不同提取方法对沙棘蛋白品质的影响

李家炜，喻勤，叶健文，相欢，崔春*

(1.完美(广东)日用品有限公司，广东 中山 528400；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广州 510640)

沙棘籽粕是沙棘籽超临界二氧化碳提取沙棘油后的副产物，目前常被用于沙棘醋[1]、沙棘果醋[2]的制备，大多数的沙棘籽粕被用作动物饲料。沙棘籽粕蛋白质含量丰富(约20%～25%)，含有18种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸以及2种半必需氨基酸，是一种优质的植物蛋白资源[3]。据报道，沙棘籽粕蛋白具有降血糖[4]、调节肠道菌群[5]的作用。除此之外，沙棘蛋白可以酶解制备活性肽如抗氧化肽[6]、醒酒和抑菌肽[7]。因此，高效提取沙棘籽粕中蛋白质是高效利用沙棘籽粕的重要途径之一。

目前关于沙棘籽粕蛋白的提取多集中在碱溶酸沉的方法上，张文博等[8]以沙棘种仁蛋白的最大提取率为目标，研究了碱溶酸沉法提取沙棘种仁蛋白的工艺，并分析了其氨基酸组成。赵晨伟[9]采用“碱溶酸沉”原理对沙棘蛋白质进行提取，确定了最佳提取条件为固液比1∶12，pH 12，时间40 min，温度35 ℃。在此条件下可使沙棘籽粕分离蛋白提取率达到79.3%，沙棘蛋白的蛋白质含量为89.67%。凌孟硕[10]以沙棘籽粕为原料，通过碱提、酶法两步提取后，总提取率为67.24%。上述研究主要集中在碱溶酸沉工艺的优化，未比较不同提取工艺对沙棘蛋白品质的影响。

本研究以脱脂沙棘籽粕为原料，分别采用水提、盐提、碱溶酸沉、先醇提后碱溶酸沉、先碱溶酸沉后醇提这5种工艺进行沙棘蛋白的提取，分析了5种工艺提取的沙棘蛋白的蛋白质含量、提取率、氨基酸组成和重金属含量，并在此基础上比较不同工艺得到的沙棘蛋白的α-淀粉酶抑制活性，确定提取沙棘蛋白的最优工艺，以期为沙棘蛋白的高值化利用提供理论基础。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与仪器

沙棘籽粕：青海康普生物科技有限公司提供；氢氧化钠、氯化钠、盐酸、乙醇、3，5-二硝基水杨酸、猪胰α-淀粉酶等：购自广州丛源仪器有限公司。

L8900氨基酸分析仪 日立公司；GL21M高速冷冻离心机 长沙湘智离心机有限公司；Varioskan Flash多功能酶标仪 芬兰Thermo Scientific公司。

1.2 沙棘蛋白的不同提取工艺

工艺1：水提蛋白，称取100 g沙棘籽粕，加入900 g蒸馏水，50 ℃搅拌提取2 h，离心取上清，浓缩，冻干即为水提蛋白。

工艺2：盐提蛋白，将工艺1得到的沉淀，加入10倍重量的蒸馏水(2%的氯化钠)，50 ℃搅拌提取2 h，离心取上清，浓缩，冻干即为盐提蛋白。

工艺3：碱溶酸沉提取蛋白，称取100 g沙棘籽粕，加入900 g蒸馏水，用2 mol/L的氢氧化钠调节pH至11，37 ℃提取40 min，重复提取3次，8000 g离心25 min收集上清液，用2 mol/L的盐酸调节pH至5.0，4 ℃沉淀24 h，8000 g离心30 min，收集沉淀，沉淀冻干即为沙棘蛋白。

工艺4：先醇提后碱溶酸沉提取蛋白，称取100 g沙棘籽粕，加入500 mL浓度为70%的乙醇，超声30 min，重复2次之后过滤得到残渣，残渣加入900 mL的蒸馏水，用2 mol/L的氢氧化钠调节pH至11，37 ℃提取40 min，重复提取3次，8000 g离心25 min收集上清液，用2 mol/L的盐酸调节pH至5.0，4 ℃沉淀24 h，8000 g离心30 min，收集沉淀，沉淀冻干即为沙棘蛋白。

工艺5：先碱溶酸沉后醇提提取蛋白，称取100 g的沙棘籽粕，加入1000 mL的蒸馏水，用2 mol/L的氢氧化钠调节pH至11，37 ℃提取40 min，重复提取3次，8000 g离心25 min收集上清液，用2 mol/L的盐酸调节pH至5.0，4 ℃沉淀24 h，8000 g离心30 min，收集沉淀，加入3倍重量的70%乙醇，超声30 min，重复2次，离心得到沉淀，冻干即为沙棘蛋白。

1.3 沙棘蛋白含量及蛋白提取率测定

蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法[11]。

(1)

1.4 氨基酸组成测定

氨基酸含量的测定采用高效液相色谱法[12]。

1.5 重金属含量测定

重金属含量的测定参照GB 5009.268-2016 《食品中多元素的测定》的方法[13]，称取不同样16 g，送样至广州检验检测集团有限公司进行检测。

1.6 α-淀粉酶抑制活性测定

α-淀粉酶抑制活性的测定参考Liu等[14]的方法并稍作修改，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法。在25 mL比色管中加入1 mL淀粉酶溶液和1 mL酶解液混合后，于恒温水浴箱(37 ℃)中预热15 min，再加入1 mL淀粉溶液(浓度2%，W/V)充分混合，于恒温水浴(37 ℃)中准确反应5 min(间隔摇晃数次后)，快速添加2 mL DNS 试剂后于沸水浴中煮沸5 min中止反应，在室温下冷却，在波长540 nm处测定吸光度，其中空白实验不添加酶解液，其他操作相同。

(2)

式中：Aa表示不添加酶解液的吸光度；Ab表示添加酶解液的吸光度。

1.7 数据统计与分析

数据均为3次测定的平均值，并使用Origin 8.0软件进行作图，采用Minitab 17.0软件进行显著性分析(Tukey方法进行比较)。

2 实验结果与讨论

2.1 不同工艺提取沙棘蛋白

分别采用水提法、盐水提取法、碱溶酸沉法、先乙醇提取再碱溶酸沉法、先碱溶酸沉再乙醇提取法对沙棘籽粕中蛋白进行提取，蛋白含量和蛋白质提取率见表1。

表1 不同工艺提取蛋白含量和蛋白质提取率的比较Table 1 Comparison of protein content and protein extraction rate by different extraction process

由表1可知，5种提取工艺的蛋白质含量差异较大，其中先醇提后碱溶酸沉工艺提取的蛋白含量最高，达77.86%；先碱溶酸沉后醇提工艺提取的蛋白含量次之，达到71.83%。就蛋白质提取率而言，含有碱溶酸沉工艺的提取率均较高，盐提工艺的蛋白含量和蛋白提取率最低。与水提法相比，在氯化钠的作用下，更多的沙棘蛋白残留在沉淀中。乙醇前处理可以显著降低沙棘蛋白中黄酮类含量。综合考虑蛋白质含量和蛋白质提取率，最终选择先醇提后碱溶酸沉作为沙棘蛋白提取工艺。

由图1可知，不同工艺提取的蛋白外观差异较大，5种蛋白颜色由浅至深分别是盐提蛋白<水提蛋白<先碱溶酸沉后醇提蛋白<先醇提后碱溶酸沉蛋白<碱溶酸沉蛋白。采用碱溶酸沉工艺提取的蛋白样品颜色均比较深，这可能是碱溶过程中大量黄酮类及木质素与蛋白结合[15]，导致样品颜色加深。

图1 不同工艺提取沙棘外观比较Fig.1 Comparison of appearance of sea buckthorn protein extracted by different process

2.2 不同工艺提取蛋白的氨基酸组成结果

5种工艺提取蛋白的氨基酸组成见表2。

表2 不同工艺提取沙棘蛋白的氨基酸组成百分比Table 2 Amino acid composition of sea buckthorn protein extracted by different process g/100 g

5种工艺提取的蛋白氨基酸组成相同，均含有17种氨基酸，但是含量差异明显。5种工艺中含量较高的氨基酸种类相同，分别是谷氨酸，其次为精氨酸和天冬氨酸。其中先碱溶酸沉后醇提之后得到的沙棘蛋白具有较高的天冬氨酸和精氨酸含量，而水提蛋白具有最高的谷氨酸含量。精氨酸在所有工艺提取的蛋白中的含量较为突出，与一般的植物蛋白相比较高，前期研究表明，精氨酸具有改善小血管冠状动脉内皮功能，免疫调节活性[16]，因此推测沙棘蛋白具有其他植物蛋白不具备的特殊生理活性。另外，沙棘蛋白中谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸含量较高，有利于新型调味品的开发[17]。

2.3 沙棘蛋白中重金属含量分析

重金属污染食品后，人体吸收后无法分解，积累到一定程度时，会引起中枢神经、血液及各器官的疾病[18]，因此对于沙棘籽粕蛋白中重金属含量的检测极为重要。参照《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[19]标注出各种重金属含量的国家标准，可见碱溶酸沉工艺、先碱溶酸沉后醇提工艺和先醇提后碱溶酸沉工艺得到的沙棘蛋白中各种重金属含量均低于国标要求，但碱溶酸沉工艺得到沙棘蛋白中铬含量达到3.19 mg/kg，远高于国标中的1 mg/kg。

由表3可知，先碱溶酸沉后醇提工艺和先醇提后碱溶酸沉工艺得到的沙棘蛋白中铅、砷、镉、汞和铬含量均明显低于碱溶酸沉工艺，表明醇提工艺可显著降低沙棘蛋白的重金属含量，其中铬含量下降最为明显，从3.19 mg/kg降低到0.35 mg/kg和0.53 mg/kg。原因可能是乙醇可提取沙棘蛋白中的黄酮和多酚类物质，黄酮和多酚类物质易与金属离子形成螯合物。

表3 不同工艺提取的沙棘蛋白重金属含量比较Table 3 Comparison of heavy metal content of sea buckthorn protein extracted by different process mg/kg

2.4 不同工艺提取沙棘蛋白的α-淀粉酶抑制活性评价

目前体外研究降血糖常以α-淀粉酶、α-葡萄糖甘酶[20]的抑制活性为评价指标。分别测定先醇提后碱溶酸沉工艺、水提工艺和盐提工艺提取的蛋白加热前后对α-淀粉酶的抑制活性，见图2。

图2 不同工艺提取沙棘蛋白α-淀粉酶抑制活性Fig.2 α-amylase inhibitory activity of sea buckthorn protein extracted by different process注：A表示先醇提后碱溶酸沉沙棘蛋白；B表示水提沙棘蛋白；C表示盐提沙棘蛋白。

结果表明，80 ℃和90 ℃热处理之后，先醇提后碱溶酸沉提取的沙棘蛋白和盐提蛋白的抑制活性降低。盐提蛋白加热前后对α-淀粉酶的抑制作用随着浓度的增加而降低。而水提蛋白80 ℃热处理之后，随着浓度的增加，其抑制作用逐渐增加，表现出浓度依赖。但是对于未加热的水提蛋白而言，随着浓度的增加，其抑制作用逐渐降低，表明盐提蛋白可能成为一种潜在的降血糖的活性蛋白。

3 结论

本研究以脱脂沙棘籽粕为原料，对不同沙棘蛋白提取工艺进行系统的研究，研究结果表明，直接碱溶酸沉、先碱溶酸沉后醇提、先醇提后碱溶酸沉这3种工艺的结果接近，其中先乙醇提取后碱溶酸沉得到的沙棘蛋白的蛋白含量最高，为(77.86±2.34)%，蛋白质提取率为(73.18±1.8)%。先醇提后碱溶酸沉得到的沙棘蛋白具有较高的氨基酸含量，氨基酸组成完全，且精氨酸的含量约为15%。乙醇处理之后得到的蛋白重金属含量较低。先醇提后碱溶酸沉得到的沙棘蛋白具有较高的抑制活性。本研究对于沙棘蛋白的提取及后续的深加工和功能性食品及调味品的制备提供了有效的理论基础。