以MOFs为载体的漆酶固定化研究进展

程 耕，成 念，王营茹

(武汉工程大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430205)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2)是一类含铜的糖蛋白氧化酶，也称为多酚氧化酶，属于多铜氧化酶家族。漆酶具有较强的氧化能力，能够以溶液中的分子氧作为电子受体催化分解多种酚类化合物，如单宁酸[1]，因此，可广泛应用于水体中有机污染物的降解以及环境中酚类物质的检测[2]。然而，游离漆酶由于难以回收、环境稳定性差、重复利用率低等而限制了其在工业污水处理中的应用，近年来，有学者提出通过固定化解决上述问题。

固定化是通过物理化学方法将天然酶固定在载体上，使游离态的天然酶成为一种非均相的催化剂存在于反应体系中，同时提高酶的环境稳定性与重复利用率。酶固定化的核心要求是：酶与载体结合稳定不脱落；酶活不降低；不影响底物与酶分子活性位点的接触。但是剧烈的固定化方法以及交联剂的使用可能影响酶的结构及性质，导致酶活降低；而温和的固定化方法则无法保证结合的牢固性。

随着材料科学的迅速发展，具有不同尺寸和性质的材料为酶固定化技术突破传统束缚提供了可能。金属有机框架(MOFs)材料是一种由金属簇或无机金属离子与有机配体桥连而成的多孔材料，也被称作多孔配位聚合物(PCP)[3]。MOFs材料具有许多优异的性能以及特殊的结构特点，如超大的比表面积、分布均匀的孔道、可调节的孔径等[4]，越来越多的研究者将其作为生物催化剂的固定化载体。MOFs材料最显著的特点是其纳米孔隙的可调控性，可以通过选用不同的中心离子与有机配体制备不同孔径的材料。根据目标物质的种类、大小、性质制备相应孔径的MOFs材料用于气体储存与分离、药物输送、催化剂负载、酶固定化等方面是目前MOFs材料研究的热点[5]。因此，作者根据漆酶固定化的3种方式：吸附法、共价结合法、包埋法，对比MOFs材料与传统载体材料用于漆酶固定化的效果，着重介绍MOFs材料作为固定化载体的独特优势，为漆酶固定化研究提供参考。

1 漆酶的结构与催化机理

1.1 漆酶的结构

漆酶是19世纪末首次从漆树Rhusvernicifera的汁液中分离得到。在自然界中发现的漆酶大多为植物漆酶和微生物漆酶以及少量的动物漆酶，工业用漆酶按照其来源可分为两大类——漆树漆酶、真菌漆酶[6]。目前广泛研究的漆酶多属于真菌漆酶，主要分布在引起白腐病的多孔菌、子囊菌、一些食用菌类以及木腐菌云芝等体内。

漆酶是一类含铜的酚氧化酶，半胱氨酸-组氨酸二肽组成了电子传递的桥梁，其活性中心含有的4个铜离子按照其光谱和电子顺磁共振(EPR)特性可分为3类：1个Ⅰ型铜离子(T1Cu)、1个Ⅱ型铜离子(T2Cu)、2个Ⅲ型铜离子(T3Cu)[7-8]。其中，T1Cu相对独立，为单核铜离子位点；T2Cu与2个T3Cu组成1个三核铜离子簇(TNC)协同发生作用。T1Cu在大约600 nm处有特征吸收峰，使漆酶表现为蓝色，因此也称为“蓝铜”[9]，T1Cu位点通过半胱氨酸(Cys)的巯氢基团以及组氨酸(His)的咪唑环分别与其相连，形成三角结构，由于Cu-S(Cys)键高度共价的性质，T1Cu具有顺磁性，能够通过EPR波谱仪测定。T2Cu没有明显的特征吸收峰，其EPR谱具有与经典四方铜配合物类似的平行超精细耦合常数(AⅡ=1.4×10-2～2.0×10-2cm-1)，能够通过EPR波谱仪测定。T3Cu为双核铜离子位点，静息氧化状态下的铜离子之间通过羟配位体进行桥连呈现反磁性，因此无法通过EPR波谱仪检测，该羟配位体在330 nm处有强吸收，能够通过UV-Vis法测定[10-11]。T2Cu与T3Cu组成的TNC有8个铜离子(6个T2Cu，2个T3Cu)通过His咪唑环配位。图1为枯草芽孢杆菌漆酶活性中心结构[12]。

图1 枯草芽孢杆菌漆酶活性中心结构

漆酶属于多铜氧化酶家族，通常来说漆酶的活性中心包含4个铜离子，但研究发现有些漆酶的活性中心只包含1个或2个铜离子。如由Phlebiaradiata产生的漆酶活性中心包含2个铜离子和1个充当Ⅲ型铜离子作用的吡咯喹啉醌[9]；真菌Phellinusribis产生的漆酶由2个质量为 76 kDa的亚基组成，其中包含1个铜离子、1个锰离子以及2个锌离子[13]。

1.2 漆酶的催化机理

漆酶属于酚氧化酶类，能够有效地完成氯酚、四环素、三氯生等酚类污染物的去除以及转化[14-16]。漆酶活性中心的4个铜离子分为2个底物接触位点：T1Cu位点和TNC位点，分别控制着催化过程的2个阶段：T1Cu位点控制底物的氧化以及中间自由基的产生阶段；TNC位点控制分子氧的还原阶段。在催化过程中，T1Cu从还原态底物吸收1个电子进行单电子氧化过程，还原态底物被氧化成自由基或活性中间体，例如漆酶与酚类物质结合能够产生苯氧自由基；随后中间体通过C-C、C-O-C、C-N等键共价结合成二聚体[17]；二聚体再作为底物被氧化产生自由基，以类似的途径形成三聚体直至生成高聚体等聚合物沉淀，达到去除污染物的目的[18]。T1Cu从底物获取电子后，通过Cys-His通道传递至TNC位点，完成以分子氧作为电子受体的四电子还原过程，最终产物为水。

Shleev等[19]对漆酶的催化机理提出如下假设(图2)：TNC从T1Cu位点接受电子后，以分子氧作为受体被还原，由“天然态中间体”(C)形成“完全还原态”(A)的漆酶，随后与分子氧继续作用，在T2Cu与T3Cu之间形成-O-O-键成为“过氧化物中间体”(B)。另一种假设是:“天然态中间体”(C)通过其氧桥的断裂而慢慢衰变，形成“静止氧化态”(D)，但是形成“完全还原态”的速率太慢，不足以产生催化效果。

图2 漆酶催化过程中铜离子氧化还原机理示意图

2 MOFs材料固定漆酶的方法及优势

漆酶是一种水溶性蛋白质，游离状态下稳定性差，在极端温度、极端pH值条件下会影响其三维结构以及活性基团的解离，导致活性降低甚至丧失。固定化可有效提高游离漆酶的环境稳定性、可回收性、重复利用率等，是一种效果明显、可操作性强、成本低的提高酶稳定性的方法。酶固定化技术的主要环节是负载方法以及载体的性能，而负载方法的选择往往取决于载体的性能，性能优良的载体须满足以下3个要求：1)载体表面存在能与酶发生偶联的活性基团，保证酶与载体之间稳定结合；2)载体具有一定的机械强度与生物相容性，载体自身不会影响酶的活性；3)载体具有可观的比表面积与孔隙率，不会影响底物与活性位点的结合。目前，一些传统的大比表面积多孔材料如石墨烯、介孔二氧化硅、多孔磁性材料以及凝胶类材料作为酶固定化载体受到广泛关注。这些传统材料虽然在一定程度上能够实现酶的固定化，但均具有一定的局限性[20-21]，如石墨烯材料制备成本相对较高、介孔二氧化硅材料存在酶的浸出、多孔磁性材料需要借助交联剂从而影响酶的活性等。

MOFs材料由金属离子与有机配体“自组装”而成，具有良好的吸附性能、可调节的孔径以及表面官能团灵活易修饰等特点，是理想的酶固定化载体[22]。与传统载体相类似，漆酶与MOFs材料的固定化方式有以下3种：吸附法、共价结合法、包埋法。同时，MOFs材料相比于传统载体有独特的优势，下面按照固定化方式介绍MOFs材料作为漆酶固定化载体的优势。

2.1 吸附法

吸附法是利用载体与酶之间的静电吸附作用、疏水作用、范德华力等物理作用使酶固定在载体上[23]。吸附法属于比较温和的固定化方法，通常是将载体与酶液混合搅拌使其吸附，固定过程不会造成酶活的损失，但是酶与载体之间作用力较弱，在使用过程中酶容易脱落流失。常见的吸附载体有无机载体：介孔二氧化硅、活性炭、硅胶等[24-25]；天然高分子载体：淀粉、蛋白质等；大孔合成材料载体：合成树脂、陶瓷材料等[26]。

海泡石是一种纤维状的硅酸镁粘土材料，具有良好的吸附性能，常用于催化剂的负载研究。Olshansky等[27]利用海泡石作为漆酶固定化载体，其对漆酶的吸附率达到了(52±2)%，并且通过测量吸附前后溶液中漆酶活性以及活性检测后漆酶的脱落情况发现，固定在海泡石中的漆酶活性提高了200%～250%。海泡石优秀的吸附性能源于其超大的比表面积以及多孔结构，其比表面积最高可达900 m2·g-1。

MOFs材料拥有均一分散的孔径，其孔隙率非常高，孔径大小、体积可以通过不同的有机配体-中心离子组合进行调控，因而具有更大的比表面积。法国Ferey课题组[28]合成了经典的MIL(material institute lavoisier)系列MOFs材料，其中MIL-101的比表面积高达5 900 m2·g-1。Zhong等[29]使用表面活性剂模板法合成了介孔Cu-MOF材料，用于漆酶固定化，通过调整模板剂CTAB与洗脱剂EDTA的比例控制所合成的Cu-MOF的孔径大小，Cu-MOF的比表面积达1 153.8 m2·g-1，其对漆酶的吸附率高达88%，同时固定化漆酶的活性回收率达95.9%。

2.2 共价结合法

MOFs材料由金属离子与有机配体之间的超分子力“自组装”而成，有机配体的多样性使得MOFs材料很容易实现功能化，通过材料表面基团与漆酶进行共价偶联，使得漆酶固定于MOFs材料表面。漆酶与MOFs材料的共价结合相对于吸附而言更加稳定。Olshansky等[27]使用壳聚糖对海泡石进行改性，以提高漆酶的固定化效果，壳聚糖改性海泡石对漆酶的吸附率高达70%，而未改性海泡石对漆酶的吸附率仅52%。

共价结合法不仅负载量优于吸附法，并且能够使漆酶的三维结构变硬，提高漆酶的环境稳定性。Skoronski等[30]将石墨烯进行硝化，随后通过硼氢化钠还原以及戊二醛交联，使漆酶以共价结合的方式固定在石墨烯上，发现共价结合法固定化漆酶在负载量增多的同时，能够重复使用8轮仍保持80%以上的活性，而吸附法固定化漆酶在重复使用2轮后便迅速失活；而且共价结合法固定化漆酶能够耐受更广泛的温度环境，在30 ℃便能达到最佳活性，远低于吸附法固定化漆酶所需要的50 ℃，这一点在工程运用中至关重要。

Patra等[31]利用固定化漆酶作为生物燃料电池的阴极，通过漆酶与ABTS的酶-介体系来提高生物燃料电池的电子传递效率，所用载体为MIL-100(Fe)材料，其比表面积高达1 350 m2·g-1，但是由于其孔径仅3 nm左右，而漆酶分子大小约为6 nm，无法进入MIL-100(Fe)材料孔道，因此使用牛血清蛋白保护漆酶结构同时利用戊二醛作为交联剂提高漆酶的固定化效果。结果表明，由于MIL-100(Fe)材料良好的电导率以及电荷转移动力学方面的出色表现，该生物电极表现出非常好的氧化还原电催化电流密度与可再现的电化学响应，在长达3周的使用中表现出极佳的稳定性。

2.3 包埋法

上述两种方法均是将漆酶分子固定在MOFs材料表面，从而提高漆酶的稳定性及环境耐受性，但是MOFs材料本身很难对漆酶分子提供保护，反应体系中的各种离子或者有机溶剂依旧会破坏漆酶结构，导致活性损失。包埋法可将漆酶分子截留、限制在MOFs材料内部，能够最大限度地保护漆酶不受环境影响，提高漆酶的重复利用率。包埋法根据作用时载体的状态可分为孔道包埋法和仿生矿化法。

孔道包埋法是将漆酶分子限制在MOFs材料的孔道中，并通过范德华力、π-π相互作用使漆酶分子被固定。虽然孔道包埋法能够保护漆酶的活性位点，明显提高漆酶的重复利用率和环境耐受性，但常见的MOFs材料孔径通常在2～3 nm，小于许多生物大分子直径，如漆酶分子直径达到了6 nm左右。因此，不仅需要设计孔径合适的MOFs材料，同时需要考虑漆酶分子的大小。目前，鲜有MOFs材料通过孔道包埋法固定化漆酶的研究。

仿生矿化法是指在载体合成过程进行固定化，也称共沉淀法、原位合成法。由于MOFs材料的孔径较小，为了将漆酶分子限制在其中，在MOFs材料合成过程中加入漆酶，以合成新型的MOFs-漆酶复合物。由于漆酶是在MOFs材料的制备过程中加入，因此MOFs材料的制备条件应比较温和，以保持漆酶的活性。传统的MOFs材料也能够通过仿生矿化法固定漆酶，常见的有海藻酸盐[32]。海藻酸盐是一种可以络合二价离子的天然高分子有机物，通常以海藻酸钠形式储存，能够在一定浓度的二价离子溶液中形成定型的固体海藻酸盐。Ratanapongleka等[33]在海藻酸钠与氯化钡溶液制备海藻酸钡的过程中加入漆酶酶液以制备固定化漆酶用以去除污染物乙酰氨基酚，固定化漆酶在pH值及温度耐受性方面有明显的提高，并且重复使用5轮后能够保持70%以上的活性。仿生矿化载体虽然对漆酶分子的保护十分到位，但是也会掩盖漆酶分子的活性位点，影响底物与活性位点的接触。研究表明，在酶加量及反应条件相同的情况下，固定化漆酶对污染物的降解率只有游离漆酶的20%左右。

MOFs材料有着可观的孔隙率，在固定漆酶后依旧能够保证漆酶活性位点与底物的结合。Zhang等[34]使用铜离子作为金属中心制备MOFs材料Cu-HKUST-1，并且先使用漆酶与氯化铜溶液进行混合接触，使漆酶上的酰胺基与Cu2+配位，形成Cu-HKUST-1的中心，随后制备固定化漆酶。对比游离漆酶与该固定化漆酶对双酚A的去除效果发现，固定化漆酶在大幅提高pH值和温度耐受性的同时，能够达到相同量游离漆酶60%左右的去除率，并且在高温、极端pH值条件下固定化漆酶具有更高的相对活性，重复使用10轮后依旧保持80%以上的活性。

3 结语

MOFs材料是一类前景广阔的漆酶固定化载体材料，在有效保护漆酶分子的同时发挥漆酶独特的四电子还原过程；具有极佳的电导率，在一定程度上可提高漆酶的电子传导效率，提高漆酶活性。但不论是MOFs材料本身的研究亦或是用于漆酶固定化的研究都处于初级阶段，还存在许多问题。MOFs材料本身属于纳米级别，用以固定漆酶之后在反应体系中依旧难以回收，需要对材料加以磁性或是再次固定在较大的载体上以便于回收。再者，MOFs材料的孔径对于生物大分子来说相对较小，不便完全利用其巨大的比表面积优势，使用仿生矿化法又对材料的制备方式有很高的要求。总之，MOFs材料固定化漆酶是跨领域材料研究的热门课题，也是正处于发展上升期的研究新课题，需要更多的创新性方案。