水产品中有机危害物残留检测技术挑战及流程展望

高磊，王钟强，覃东立，陈中祥，王鹏

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（哈尔滨），黑龙江 哈尔滨 150070；3.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141；4.河北省水产技术推广总站，河北 石家庄 050021）

关键字：水产品质量安全；检测技术；有机危害物

1 水产品中有机危害物残留检测中的挑战

1.1 水产品中有机危害物残留现状

农业农村部办公厅于2018 年发布《乡村振兴科技支撑行动实施方案》，倡导提质增效模式[1]，目前应提质增效为导向，加快推进水产养殖业绿色发展。民以食为天，食以安为先，确保老百姓“舌尖上的安全”，关系到人民健康生活。目前农业农村部等相关部门相继推出了多种检测制度。根据其公开数据显示，2013 年以来，随着国家养殖水产品和苗种产地抽查等任务的开展，截至2019 年均没有发生重大水产品质量安全事件，连续6 年合格率保持在99%以上[2,3]。

1.2 发现问题及存在风险

虽然所监测的水产品中常用药物（包括但不限于硝基呋喃类代谢物、孔雀石绿类、磺胺类、喹诺酮类和氯霉素类等）已经得到了很好的控制。但仍然存在着如检测周期长、非靶向有害物污染、假阴性、假阳性及标准规定滞后性等挑战。

1.2.1 检测周期长

参考农业部783 号公告-1-2006 标准以水产品中硝基呋喃类代谢物的检测为例，需要在检测前经过样品采集、制备、前处理及仪器分析检测过程[样品制备（鱼体→去皮→剔肉→搅碎→四分→匀浆→分装）→冷链带回实验室→待测物提取富集净化（加入内标→加入衍生化试剂→加入盐酸→震荡16 h→加入缓冲盐→加入萃取剂→涡旋→离心→去上清液→再次加入萃取剂→涡旋→离心→取上清液→合并提取液→氮气吹干→重新溶解→过滤→装进样瓶）→仪器分析检测]，其复杂的前处理流程往往需要2 d 以上。而其中的仪器分析检测部分往往用到液相色谱串联质谱等高精度的大型检测仪器，一般需要恒温、恒湿、无振动的工作环境，因而必须在实验室进行样品分析。待检测完毕再出具检测报告往往需要等到第三天之后，不合格的水产品有流入市场的风险，存在检测周期长的缺陷。

1.2.2 非靶向有害物污染

目前的检测标准往往是靶向检测，而针对非靶向有机污染物却无能为力。随着稻鱼互作、稻蟹互作等养殖方式在全国推广，种植用田中所用的农药可能通过雨水冲刷、地表径流等作用渗透到池塘中，引起池塘中除草剂的残留污染。而这些非靶向监测物质很可能影响水产品质量安全。2017 年，乔丹[4]对山东沿海13 个县区贝类养殖基地中16 种除草剂（含酰胺类除草剂：乙草胺、异丙甲草胺）进行筛查，发现检出率高达69.7%，而国外也在环境中发现了大量酰胺类除草剂的残留[5]。本文前期调查研究中也发现黑龙江渔业水域及水产品中有丁草胺残留。酰胺类除草剂（甲草胺、丁草胺等）被我国分类为高毒级的农药，美国环境保护局也将甲草胺、乙草胺和丁草胺等定义为B-2 类致癌物，异丙甲草胺定位C 类致癌物[6]。其中甲草胺和乙草胺能显著增强人类淋巴细胞姊妹染色体的交换频率，降低人类精子的存活率和运动性[7]。丁草胺具有致突变性[8]，会提高染色体畸变概率[9]。酰胺类除草剂在水生生物中的毒性更强，比哺乳动物毒性高500～10 000 倍[10]。高浓度丁草胺可诱发黄鳝（Monopterus albus）染色体数目畸变，染色体单体发生裂隙、断裂[11]。乙草胺、丁草胺和异丙甲草胺在大鼠体内经细胞色素P450 酶系、芳基酰胺酶等一系列催化作用下会形成强致癌作用的二烷基醌亚胺[12]。而丁草胺这种除草剂往往并不在水产品检测的靶向列表中，可能会面临非靶向有机危害物的污染问题。

1.2.3 氨基脲的假阳性及检测的假阴性

根据王建的研究总结[13]，孟加拉国虾的外壳存在着高含量的氨基脲（SEM），它在小龙虾（Procambarus clarkii）肉中呈游离状态，含量在0.4～12 μg/kg，其是否存在与添加呋喃西林没有任何的关系。在食品工业中用来增稠的卡拉胶很可能是SEM的一种来源，因而其认为SEM 作为唯一的标志物来检测呋喃西林已经不现实。因此，现行的检测标准有可能会因为内源性的问题误判为阳性，存在假阳性检测风险。

目前如液相色谱紫外，液相色谱荧光、气相色谱电子捕获和气相色谱火焰离子化等检测器的特异性不强，其定性往往主要依靠保留时间，当基质干扰较大时，往往会造成目标出峰时间周围有较大响应信号的共流出物，造成检测结果的假阴性。而目前较为先进的定性手段多采用LC-MS/MS 确证，而质谱法本身的仪器特点，当涉及到高浓度盐、非离子型表面活性剂等因素的干扰，也会影响其在电喷雾电离源的电离，引起检测结果的不确定性，甚至引起假阴性[14]，也会存在一小部分假阴性检测风险。

1.2.4 部分检测标准或规定的滞后性

采用的部分检测标准往往还较为滞后，例如孔雀石绿采用《GB-T-19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》检测方案，硝基呋喃类代谢物采用《农业部783 号公告-1-2006 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱－串联质谱法》检测方案，磺胺及喹诺酮类抗生素采用《农业部1077 号公告-1-2008 水产品中17 种磺胺类及15 种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱－串联质谱法》检测方案，氯霉素，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考《GBT 20756-2006 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》检测方案。其标准大多为2005—2008 年的标准，距今已有十余年，因此标准具有一定的滞后性。

目前检验检测增殖放流经济水产苗种中的氯霉素仍按照《农业部办公厅关于开展增殖放流经济水产苗种质量安全检验的通知》（农办渔[2009]52号）[15]规定，采用酶联免疫试剂盒ELISA+气相色谱仪确证或气相色谱质谱法规定的方法检验水产苗种药残。而《SC/T 3018-2004 水产品中氯霉素残留量的测定气相色谱法》方法涉及到提取→脱脂净化→C18 柱净化→衍生化（标准溶液亦需衍生化）→仪器分析测定，其相比于《GB/T 20756-2006 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法》液相色谱串联质谱法（提取→净化→仪器分析测定）操作复杂。LC-MS/MS 采用了多反应监测模式会使得氯霉素的定性更加准确，抗基质能力更强，得到更低的检出限（LC-MS/MS：0.1 μg/kg；GC-ECD：0.3 μg/kg）。据此，建议可对氯霉素的LC-MS/MS 方法进行验证，如方法具备可行性，可使有条件的检验检测机构选优先选用液相色谱串联质谱测定氯霉素，可增加其作为常规的检测方法，以提高检测效率和定性准确性，获得更好的检出限。

以往传统的检测技术因前处理或分析过程有检测周期长的问题；所常用的标准检测手段往往是靶向检测，无法针对非靶向物质进行筛查，违法者可通过避开靶向检测物以达到检测结果合格的目的，存在着逃避靶向检测的风险；而检测技术的不完善也制约着检测结果，有可能出现检测结果的假阳性、假阴性、标准滞后性等问题。因此，未来可通过改变当前的检测流程来完善水产品质量安全体系。

2 未来水产品有机危害物检测技术流程的展望

未来水产品检测技术流程可采用“先撒网筛查，后准确定性”的检测方针，具体如图1 所示。

图1 水产品检测流程展望Fig.1 Process of fishery product detection technology

2.1 现场快检

为解决传统检测周期长的问题，可应用不同的机理设计出对常规靶向待测物的快检试剂盒，优先应用于活体现场快速检测，在水产品流入市场前即可获得准确结果。目前较为成熟的技术包括化学比色法[16]、酶联免疫法[17,18]、胶体金免疫层析法[19,20]、量子点荧光免疫分析法[21,22]及表面增强拉曼光谱[23]等。开发出更为快速、高灵敏度的前处理及准确定性定量的现场快检技术，在短时间内准确定性定量，不需要复杂的人和机器，使渔民及监管机构买得起、用的起、用的懂。解决传统采样→制样→回实验室→前处理→仪器分析检测过程中检测周期长带来的风险，在水产品流通到市场前得到有效的风险排查。食品中部分快检技术已经得到了应用[24,25]，在监管中发挥重要作用[26,27]。除了要从源头上控制水产品质量安全，还需要可靠的现场快检技术作为支撑以保障人们的食品安全。

2.2 风险筛查及预警

为控制非靶向有害物、假阴性及假阳性的风险，可采取风险筛查及风险预警的措施。

2.2.1 风险筛查

针对目前的有害物质制定筛查表格（下至几百种，上至上万种），采用高分辨质谱对表格中有机危害物进行高通量筛查，不仅可筛查待测的水产品，亦可同时筛查渔业环境样品（如水环境，底泥环境等）和渔业投入品等。选择不同性质的物质作为质控样品，验证方法准确性，通过保留时间、精确分子量、同位素丰度比、二级谱图等多方面信息提早发现风险物质。筛查的目的为尽可能的保留全部信息，其前处理过程较靶向检测简单，高分辨质谱数据具有可追溯性，可在多年后分析当年的检测数据，以便在未来重新挖掘以往的数据。采用高分辨质谱风险筛查还可以在没有标准品的环境下进行初步筛查，降低实验室采购标准品的成本。例如，Gao 等[28]采用了25 种不同性质的物质（含有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、四环素类抗生素、磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、酰胺类除草剂、三嗪类除草剂和杀菌剂等），验证了并联固相萃取方案，解决了非靶向有机危害物流入、假阴性和假阳性的风险问题。所选用的质控物质如表1 所示。

表1 并联固相萃取方法中质控物质的筛查限及回收率Tab.1 Screening detection limit and recovery of quality control compounds with different properties in the parallel solid phase extraction

2.2.2 风险预警

利用高分辨质谱数据的追溯性，可保存平时的“阴性”水和底泥等环境样本，在水产品发生风险时，可对高分辨质谱数据进行追溯。将已有风险的污染样本A（图2 左）对照阴性样本B（图2 右）。Gao等[28]建立了无差别无歧视的盲筛对比表格，分析得到信号值差异最大的几组数据。由图2 可知，样本A 在5.80 min 时，一级质谱图中有216.1009 Da 的响应，其具有二级谱图（104.0023 Da、146.0218 Da、174.0539 Da、216.1048 Da）。而反观样本B，在同样的出峰时间（5.80 min）却没有216.1009 Da 响应。进一步结合精确分子量、同位素丰度比等进行判断，初步判断出候选物质C8H14N5Cl（误差为0.2 ppm）、C13H13NO2（误差为-3.7 ppm）、C9H9N7（误差为8.7 ppm）、C8H13N3O4（误差为14.9 ppm）和C10H17N2O2S（误差为-19.3 ppm）。根据二级质谱图（104.0023 Da，146.0218 Da，174.0539 Da，216.1048 Da）裂解规律判断碎片离子，判断碎片离子为C8H15N5Cl+（216.1048 Da，误差为3.8 mDa）、C5H9N5Cl+（174.0539 Da，误差为-0.2 mDa）、C5H9N3Cl+（146.0218 Da，误差为-26.2 mDa）和C2H3N3Cl+（104.0023 Da，误差为1.3 mDa）。判断污染物可能为阿特拉津。后续可根据风险预警的判断结果再进行下一步的确证。待验证正确后，将其加入信息数据库共享，可为日后风险预警提供技术支持。

图2 风险预警筛查得到的特异物质总离子流图、一级质谱图（MS1）及二级质谱图（MSn）Fig.2 The total ion chromatogram,MS1 and MSn spectra of the compound obtained from risk warning screening

2.3 多方面确证

针对筛查出的有毒有害可疑风险物质，采取多谱图结合的方式，如质谱+色谱+光谱+核磁等多谱图验证，解决假阳性问题。以并联固相萃取高通量前处理为技术为基础，结合LC-Q-TOF-MS 筛查技术，对东北地区部分池塘进行了污染物的高通量筛查，结果在哈尔滨某渔业养殖基地水源中筛查到有丁草胺的残留。随后又分析了此水环境中的鲤（Cyprinus carpio）样品的数据，提取特征母离子312.17303 Da 的萃取离子流图（XIC）（图3-A），发现在7.77 min 时，有一个强度仅为40 的疑似丁草胺峰（图3-B）。由于其MS1 丰度较低，信息依赖采集模式并没有采集到其子离子（图3-C）。

图3 鲤中污染物的萃取离子流图（A），MS1 图（B）及MS2 图（C）Fig.3 Extracted ion chromatogram（A）,MS1（B）and MS2（C）of pollutants in common carp

为进一步鉴定该污染物，采用液相浓缩方式将7.50～8.00 min 的馏分进行多次收集浓缩（色谱的TIC 图如图4-A 所示），并进一步采用泵直接进样的累加模式采集馏分的MS1（图4-B）和MS2（图4-C）谱图。发现312.1735 Da、313.1771 Da 和314.1705 Da 等几个MS1 特征峰，及238.0972 Da、162.1270 Da 和57.0713 Da 等几个MS2 特征峰。对MS2 进行分析，通过理论分子模拟、碎片裂解规律，解析出了C13H17NOCl+（238.0993 Da）、C11H16N+（162.1277 Da）和C4H9+（57.0699 Da）三个MS2 碎片离子信息。根据《东北地区主要涉渔农药及鉴别》图书中第三章“涉渔农药色谱－质谱图集”报道[29]，其指纹图谱库如图4-E 所示。通过以上信息及自建的标准指纹图谱库比对，及根据欧盟对有机物的判定规则[30]，其高分辨质谱的母离子加2.0 分，每个子离子加2.5 分。此化合物打分为2.0+2.5×3=9.5 分，已经超过其规定的分数。故可判定7.77 min 的312.1735 Da 物质就是丁草胺污染物（结构式如图4-D 所示，解析结果如图4 箭头所示），证实该环境下鱼肉样品为阳性。

图4 浓缩后污染物的色谱图（A），MS1 图（B），MS2图（C），丁草胺结构式（D），图书中丁草胺指纹图谱库（E）Fig.4 Chromatograms（A）,MS1（B）,MS2（C）of compound after concentration,structure of butachlor（D）,and library of butachlor（E）

其中筛查及确证技术在其他农产品领域也有部分应用。谢瑜杰等[31]采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱快速筛查蔬菜中农药，孟志娟等[32]结合气相色谱-四极杆-飞行时间质谱筛查水果蔬菜中农药；王思威[33]和雷汝清[34]等分别应用高分辨质谱非靶向筛查了蜂巢蜂蜜中的农药及西红柿中杀菌剂等有机危害物。采用实验室进行风险筛查及预警进而进行多方面验证可互补现场快检方案。

2.4 数据追溯及风险控制

可追溯的数据可尽可能地控制风险。检测过程中保留经典高分辨质谱数据（含信息依赖性扫描及全扫描图谱）十分必要，可以保留“阴性”样本，达到数据可追溯的目的。由于水产品富集倍数不足的原因，可能当时无法筛查出风险物质丁草胺。当发现其中的一个样本中含有某个风险物质时，可以利用高分辨质谱数据的可追溯性针对性地观察某个物质。如2.3 节中已知水环境中含有丁草胺的残留，于是追溯其环境和水产品中丁草胺的含量，发现其环境中鲤7.77 min 时的312.1735 Da 物质，并对其进行富集检测及分析、验证。目前受到检测技术发展的制约，可能造成检测的假阴性，原因可能是水样品经过了固相萃取大体积的富集浓缩，很容易将污染物富集从而提高了浓度；水环境样品的净化提取更为简单，而水产品的细胞破碎困难，使得常规方法不能有效提取污染物，造成提取效率低、回收率低；水样品基质简单，更容易从众多的杂峰中找到污染物，而水产品肌肉基质复杂，含杂质多，采用非选择性的前处理手段会影响除草剂的分离，会将其低丰度的特征峰（如312.1735 Da、313.1771 Da 和314.1705 Da）误认为杂质。如今受到检测技术发展的瓶颈，会导致样品出现“假阴性”，因此随着检测技术的飞速发展，保留“原始数据”的文件十分必要，可为后期追溯及溯源提供保障。

2.5 提升检测科研水平

目前水产品检测技术中针对呋喃西林的代谢物氨基脲（SEM）的检测往往存在一定的假阳性风险。随着我国科研水平的提高，检测技术也在不断完善。王建[13]研究认为，采用2-硝基苯甲醛作为衍生化试剂很可能无法准确鉴定不同来源样本中的SEM，采用硝基糠醛作为生物标示物，可有效避免检测中非呋喃西林源和呋喃西林代谢产生的SEM 的馄淆，解决SEM 检测过程中的假阳性问题，当标准得以验证后亦可对标准进行更新，解决标准滞后性的问题。

随着我国检测科研能力的提高，会逐步解决检测过程中出现的假阴性、假阳性及标准滞后性等问题。针对现在主动用药的监管已经成熟的条件下，对“被动”用药的研究还需要更加深入，要理清药物的来源，查清渔用投入品、饲料、非药品类渔用投入品、水源、底泥、周边环境等。通过快检来快速筛查以达到加快现场监管，通过高通量筛查对“被动”用药实现风险筛查，利用多方面信息确证有机危害物，最终实现风险防控。

3 结语与展望

本文提出了水产品中有害物残留检测所遇到的挑战，展望了未来水产品检测的发展新思路。这种以现场快检初步定性定量，并在实验室进行高通量非靶向风险筛查及预警，结合多方面确证有机危害物，可以做到数据可追溯、风险可控制，终端可快检，实验室检测准，具有时效性强、可覆盖面广的优点，能在一定程度上保障我国水产品质量安全。目前水产品质量安全还任重道远，高端分析仪器国产化、高精尖人才本地化，这都需要涌现出一批年轻力量。相信随着检测科研的投入，未来检测手段将有新的突破。在目前互联网的大潮中，可推进“互联网+水产品质量安全”，可实现实时更新我国水产品质量安全情况，建立信息公开化的水产品有机危害物数据库，构建信息追溯平台，以实现新时代中国绿色水产品的美好愿景。