儿童急性淋巴细胞白血病中miR-326的表达及临床意义

卓艳霞，孙明昌，张永卓

（濮阳市人民医院，河南濮阳 457000）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是最常见的白血病之一，在15岁以下的儿童中发病率最高[1]。虽然有研究表明，患有急性淋巴细胞白血病的儿童的五年总生存率近年已达到90%以上，但其高复发风险和较差的预后仍然是目前临床治疗上较为棘手的问题之一[2]。因此，找到在儿童急性淋巴细胞白血病中具有较高价值的生物标志物成为当务之急。

MicroRNA（miRNA）是一大类单链非编码小RNA（ncRNA），在调节各种基本的生理作用中扮演着重要的角色，其表达失调可能会在很大程度上导致癌症的发生发展[3-4]。有研究表明，低表达的miR-326与多种肿瘤的发生、发展、转移、不良预后等密切相关。例如，miR-326的下调与食道鳞状细胞癌、非小细胞肺癌（non-small-cell carcinoma, NSCLC）患者的转移风险呈正相关[5-6]。有研究发现，miR-326在胃癌细胞中的表达明显降低，上调miR-326的表达可以通过下调NOB1的表达来抑制胃癌细胞的增殖[7]。相关研究人员发现miR-326在前列腺癌细胞中低表达，提示其可以作为前列腺癌诊断的生物标志物[8]，但在儿童ALL中的相关研究还比较少。因此，本研究将以此为出发点，探讨骨髓组织miR-326在儿童急性淋巴细胞白血病中的诊断及预后意义。

1 资料与方法

1.1 样本收集

收集在2014年8月～2019年8月期间来我院接受治疗的70例儿童急性淋巴细胞白血病患者资料（均为新患者，不包括复发患者）归入研究组。另收集30名健康志愿者资料归入对照组，两组间各基线水平未展现出统计学差异性，具有可比性。在健康志愿者中，未有人被诊断出患有任何急性淋巴细胞白血病。本研究已获得本院伦理委员会的批准和同意，所有患者的家长均签署知情同意书。

分别采集5ml各参试患者和健康志愿者的血液样本，使用lymphoprep人淋巴细胞分离液（购自上海山进生物科技有限公司，货号：1114544）进行密度梯度离心，得到含单个核细胞的血清后将其保存在-80℃的环境下。

1.2 RNA提取及定量聚合酶链反应（qRT-PCR）

使用Trizol试剂（Ambion，卡尔斯巴德，加利福尼亚）按照说明书从组织样品中提取总RNA。将分离出的RNA（2μg）使用PrimeScript TM RT试剂盒（Takara，Shiga，Japan）合成用于聚合酶链反应分析的cDNA。在37°C进行15min逆转录反应，然后在85°C进行5s的逆转录酶失活，将获得的cDNA储存在-20°C的环境下。根据相应试剂盒说明书在SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-（QPK-212，Toyobo Co，Ltd，大阪，日本）系统上进行PCR反应。按照以下条件进行30个热循环：95°C预变性5min，95°C变性20s，60°C退火30s，以及72°C延伸30s。GAPDH作为miR-326表达的内参。用2-ΔΔCt方法计算miR-326血清相对表达水平。实验所用到的基因的引物设计见表1：

表1 引物设计

1.3 统计方法

所有研究数据均使用GraphPad Prism软件和SPSS 23.0软件进行分析和处理。利用ROC评估miR-326在儿童ALL中的诊断及预后价值。计量资料用均数±标准差表示，数据统计采用χ2检验和Fisher精确检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

1.4 随访

70例患者每月随访一次，检测患者体内的miR-326表达水平的不同，观察患者的预后效果。随访期从患者接受治疗的第一天开始，截至2019年8月31日，70例患者随访6～60个月，随访时间中位数为32.5个月。共有2例患者失访，总随访率为97.1%。总生存期（overall survival, OS）是指患者从接受治疗开始到因任何原因引起死亡的持续时间。无进展生存期（disease-free survival, DFS）是指患者从接受治疗开始到病情发生进展或复发的生存时间。

2 结果

2.1 miR-326在ALL组织中表达下调且具有较好的诊断价值

此次研究使用qRT-PCR检测了所有血液样本中的miR-326的表达水平，结果显示，儿童ALL患者血液样本中的miR-326表达水平明显低于正常血液样本（图1A）。根据此次研究中ALL患者和正常样本中血清miR-326表达水平绘制ROC曲线。由曲线可知，曲线下面积（area under the curve, AUC）：0.876；Cut-off值：1.875；敏感度：86.7%；特异性：92.9%；约登指数：79.6%。表明miR-326诊断儿童ALL具有很好的敏感度和特异性，且具有较好的诊断价值。由此可见，根据miR-326的表达水平可以将儿童ALL患者与健康志愿者有效进行区分，见图1B：

图1 miR-326在正常血液和儿童ALL血液中的表达水平及诊断价值

2.2 miR-326表达与儿童ALL患者临床病理特征的关系

此次研究将儿童ALL患者按照其miR-326的表达平均值分为高表达组（n=22）和低表达组（n=48），采用Fisher精确检验检测miR-326的表达水平与儿童ALL患者临床病理因素的相关性。其中年龄、性别、T/B分型、临床分型等与miR-326在组织中的表达水平无明显相关性（P＞0.05）。见表2：

表2 患者的临床病理因素

2.3 miR-326的低表达提示患者预后不良和较差的生存率

根据整个随访期间miR-326表达量的中位数将儿童ALL患者分为高表达组和低表达组，记录患者在随访期内的生存时间，进行总生存分析并绘制生存ROC曲线图。另外，按病情是否进展对患者进行分组，进行无进展生存分析并绘制进展ROC曲线图。总生存分析结果显示，miR-326高表达组的总生存期明显比低表达组的总生存期延长，低表达的miR-326提示较差的总生存率（图2A）。无进展生存分析结果显示，miR-326高表达组的无进展生存期明显比低表达组的无进展生存期延长，低表达的miR-326提示了较差的无进展生存率（图2B）。儿童ALL患者生存ROC曲线显示AUC值：0.909；Cut-off值：1.665；敏感度：88.9%；特异性：81.2%；约登指数70.1%（图2C）。进展ROC曲线显示AUC值：0.815；Cut-off值：1.64；敏感度：90.2%；特异性：73.7%；约登指数：63.9%（图2D）。以上数据提示了低表达的miR-326与儿童ALL患者较差的预后相关。

图2 miR-326总生存率和无进展生存期及对应的预后价值

3 讨论

ALL是指由于骨髓、血液和其他造血器官中的淋巴母细胞单克隆活化和扩张而引起的一组淋巴样疾病。儿童ALL是最常见的儿童恶性肿瘤，占所有儿童癌症的25%，占所有儿童白血病类型的80%[9]。在过去的几十年里，儿童ALL的诊断和治疗技术取得了很大的进步，治愈率从原来的10%提高到90%，整体的生存状况有所改善[10]。到目前为止，儿童ALL主要以是否有发热、出血、贫血等症状，体检有无肝、脾、淋巴结肿大及胸骨压痛，有无血小板减少，骨髓中一系列原始细胞含量是否超标，作为诊断依据。但由于确诊的因素太多，偶尔会出现诊断不及时或者与其他疾病混淆，耽误最佳治疗时间[11]。同时，尽管治愈率越来越高，较高的复发率仍然是儿童ALL治疗中最为严峻的挑战。因此，本研究目的在于寻找到可用于临床早期诊断儿童ALL的可靠生物标记物和预后标记物，以提高诊断的精准性并尽早识别出具有高复发风险的患者。

miR-326是microRNA家族中的一员，在各种生理过程中扮演着重要的角色。相关研究人员发现，在胃癌中，miR-326的低表达与临床分期、肿瘤深度、淋巴结转移和远端转移有关。生存分析表明，miR-326的低表达是胃癌患者预后不良的标志[12]。此外，在食管鳞状细胞癌患者中，miR-326的低表达与不良预后相关[13]。还有研究发现miR-326在肺癌组织中显著下调[5]。在本研究中，我们收集了70份儿童ALL患者的血液样本和30份健康志愿者的血液样本，同样地，qRT-PCR检测结果显示儿童ALL患者血清中的miR-326的相对表达量较健康志愿者明显下调。ROC曲线结果显示AUC值为0.876，表明检测miR-326的表达水平可以区分健康人群与儿童ALL患者。总生存分析结果显示，miR-326高表达组的总生存期明显比低表达组的总生存期延长，低表达的miR-326提示较差的总生存率；儿童ALL患者生存ROC曲线显示AUC值为0.909；无进展生存分析结果显示，miR-326高表达组的无进展生存期明显比低表达组的无进展生存期延长，低表达的miR-326提示了较差的无进展生存率；无进展ROC曲线显示AUC值为0.815。以上数据表明miR-326低表达与较差的预后相关。有研究人员发现，miR-326在神经胶质瘤组织中的低表达也是整体生存预后不良的独立标志[14]。此外，相关研究人员发现，miR-326的表达水平在儿童ALL患者的预后中具有良好的诊断价值[15]，这与我们的研究结果比较一致。

虽然此项研究对于儿童ALL的早期诊断和预后具有一定的意义，但此次研究只纳入了70例患者，样本量较少，导致miR-326在儿童ALL中的表达量还不够精确。需在以后的研究中加大样本量，确定一个更准确的值以用于儿童ALL的早期诊断和预后标志物。综上所述，miR-326有可能成为儿童ALL的早期诊断和预后标志物。