miR-708在儿童急性淋巴细胞白血病中的诊断及预后

王丽娟，刘 燕

（1.中原油田疾控中心临床医疗科，河南濮阳 457000； 2.中原油田总医院核医学科）

淋巴母细胞性白血病是一种恶性肿瘤，其中儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）占所有儿童癌症的25%以上[1-2]。为提高儿童ALL的诊治效率，急需寻找与儿童ALL相关的有效生物标志物。

miRNA是一种非编码的单链小RNA，研究报道，改变miRNA表达水平与一些实体肿瘤和血液肿瘤息息相关[3-4]，例如肺癌[5]和慢性淋巴细胞白血病[6]等。另有研究表明某些miRNA可以作为ALL诊断的分子标记物[7]。MicroRNA-708（miR-708）的异常表达与细胞迁移、侵袭、凋亡和增殖密切相关[8]，然而，miR-708在ALL中临床价值的相关研究较少。

本研究通过分析miR-708在儿童ALL患者血样中的表达水平，评估miR-708是否可以作为儿童ALL诊断和预后的分子标记物，以期对儿童ALL的临床治疗提供有效策略。

1 材料和方法

1.1 样本采集

采集2015年5月～2016年5月自我院就诊的110例儿童外周血液样本（ALL血样90例，健康血样20例），其中ALL血样来自我院儿科肿瘤科。经过临床、形态、细胞化学、流式细胞仪和细胞遗传学分析后确定免疫表型和遗传亚型，其中包括79例急性前B淋巴细胞白血病（pre-B lymphocytic leukemia，Pre-B-ALL）以及11例急性T淋巴细胞白血病（acute T lymphocytic leukemia，T-ALL），所有病例均符合ALL诊断标准。从每位新诊断为儿童ALL患者和健康儿童对照组中采集3～6ml血液样本。本次实验已获得儿童法定监护人的知情同意和本市伦理委员会的批准。

1.2 实时荧光定量PCR

按照制造厂家的建议并遵循Trizol试剂盒（Thermo Fisher）说明书的实验步骤提取儿童血液样本中的总RNA，并在260nm和280nm处用分光光度法测定提取的RNA的浓度和纯度；以OligodT为引物，并按照反转录试剂盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor，货号：4374967，Thermo Fisher）的实验步骤，反转录得到与miR-708互补的cDNA；按照Fast SYBR™Green Cells-to-CT™Kit 试剂盒（Thermo Fisher，货号：4402956）实验步骤，在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher）上进行qRT-PCR，实验以U6作为内参基因，利用2-ΔΔCT方法计算miR-708在血液样本中的表达水平。qRT-PCR反应条件为：95°C持续10min，95°C持续15s，60°C持续1min并做40个循环。qRT-PCR所需引物见表1：

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 随访

所有儿童ALL患者每月随访一次，随访的办法主要是检测患者血液中miR-708的表达水平，来推测患者预后效果。患者的随访期为患者接受治疗开始算起截止到2020年5月。一共有90名患者随访了10～60个月，期间有2个患者失访，总随访率为97.78%。无进展生存期的定义为从治疗之日至复发之前的生存时间，总生存期的定义为从治疗之日到死亡或失访所经历的时间。

1.4 统计方法

所有实验至少独立重复3次，数据表示为平均值±标准偏差（mean±SD）。所有研究数据均应用GraphPad Prism 6.0和SPSS 19.0统计软件进行分析和处理。利用非配对t检验、χ2检验、Fisher精确检验，检测两组数据之间的差异；利用Kaplan-Meier方法进行生存分析，并使用对数秩检验进行miR-708高、低表达组生存曲线之间的比较；应用接受者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估miR-708的诊断潜力，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-708在儿童ALL患者中显著上调

实验研究对象分为两组，其中确诊为ALL的为患者组共90例（81.82%），健康对照组20例（18.18%）。实验中使用qRT-PCR检测所有血液样本中miR-708表达水平。实验数据表明，患者组中miR-708显著上调。见图1：

图1 miR-708表达水平箱型图

2.2 miR-708在儿童ALL患者中的诊断意义

通过绘制受试者操作特征曲线以检测候选miR-708的诊断价值，ROC曲线数据显示miR-708的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.882，敏感度为92.2%，特异性为80.0%，Cut Off值为42.13，约登指数为0.722，95%置信区间（95% Confidence interval，CI）为0.777～0.986。AUC值＞0.5说明miR-708在儿童ALL中具有良好的诊断潜力，约登指数说明miR-708作为筛选条件辨别患者与非患者的总能力较高，并且灵敏度和特异性较好。见图2：

图2 miR-708在儿童ALL中的诊断价值

2.3 miR-708表达水平与儿童ALL患者临床病理特征因素之间的关系

以miR-708表达水平的ROC曲线中的Cut off值（42.13）作为临界值，将患者分为高表达组（n=50）和低表达组（n=40），并利用Fisher精确检验或者χ2检验检测miR-708的表达水平与儿童ALL患者临床病理因素之间的相关性。其中性别、白细胞数量、是否涉及中枢神经系统（central nervous system，CNS）、第33天的微小残留病变（minimal residual disease，MRD）与miR-708的表达水平无明显相关性（P＞0.05），而年龄和免疫分型与miR-708的表达水平显著相关，见表2：

表2 miR-708 表达水平与儿童ALL患者临床病理因素之间的关系

2.4 儿童年龄和免疫分型与miR-708在ALL患者中的表达显著相关

由表1可知，儿童年龄和免疫分型都与miR-708在儿童ALL患者中的表达水平具有明显的相关性（P＜0.05）。我们进一步通过箱型图验证了两种病理因素与miR-708的具体相关性。由图可知，1～9岁ALL儿童患者中的miR-708表达水平显著高于大于9岁的儿童患者（图3A）；Pre-BALL儿童患者中的 miR-708表达水平也显著高于T-ALL患者（图3B）。

图3 儿童年龄和免疫分型与miR-708表达显著相关

2.5 miR-708表达水平在儿童ALL患者中的预后评估

随访期间，miR-708高表达组ALL 共有11例复发（复发率为1-无进展生存率），复发率为22.0%，miR-708低表达组ALL 共有1例复发，复发率为2.5%，高表达组复发率远远高于低表达组；无进展生存期曲线显示，miR-708低表达组患者的无进展生存期较高表达组显著延长（图4A），具有统计学意义（P=0.024）。总生存期生存分析结果表明，miR-708高表达组患者和低表达患者总生存率分别为82.0%和97.5%，且miR-708低表达组总生存期明显较高表达组的总生存期延长（图4B），说明miR-708低表达组预后效果显著高于miR-708低表达组（P=0.026）。

图4 在儿童ALL患者中 miR-708高、低表达组的生存分析

3 讨论

ALL作为一种恶性肿瘤在儿童中十分常见，据统计，ALL约占儿童所有癌症的25%[9]。作为未成熟血细胞前体，即胚细胞癌变和恶性增殖的结果，其特点为增殖速度快且经常没有明显的预兆，因此难以发觉[10]。经过生物医学界几十年的努力，临床上改进的抗白血病药物、化学疗法以及放射疗法都极大改善了ALL治愈率和生存率，使其治愈率提高了近80%，五年生存率提高了近85%，在ALL治疗上取得了极大成功[10-12]。为了提高儿童ALL患者的诊断能力以及临床治疗后的预后情况，临床上急需一种可靠的生物标志物。本文探讨了miR-708作为儿童ALL诊断和预后的生物标记物的可能性。

已有学者表明miRNA可以作为儿童ALL诊断和预后的生物标志物，例如：miR-143和miR-182可以作为儿童ALL经BFM化疗治疗后的预后分子标记物[13]；miR-200c和miR-326在儿童ALL中具有潜在的诊断作用，miR-326的下调可作为儿童ALL耐药的预后因素[14]。以上相关研究提示了miRNA在儿童ALL中的临床诊断和预后意义。

有相关文献证明，低表达的miR-708与前列腺患者的诊断和不良预后相关[15]；高表达的miR-708可作为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）早期诊断的生物标志物[16]。有相关研究利用微阵列分析（n=43）儿童ALL全基因组的miRNA表达谱，发现在骨髓样品中包括miR-708在内的13个miRNA均显著上调[17]。此外，有研究者在B淋巴细胞白血病（B lymphocyte leukemia,B-ALL）、T-ALL和急性髓细胞性白血病（acute myelocytic leukemia, AML）患者RNA样本中测量了人类miRNA的表达情况，并利用细胞数据库构建了miRNA网络。结果表明，miR-708与以B-ALL为中心的miRNA网络连接最为紧密，并且在B-ALL网络中特异性高表达，这提示了miR-708可能作为B-ALL的一种分子标记物。与T-ALL和AML相比，在大多数B-ALL细胞系中的miR-708均上调，这也进一步说明miR-708有可能是B-ALL的生物标志物[18]。有趣的是，有的学者发现miR-708-5p在儿童ALL中的表达很有特点，miR-708-5p相对于整个患者组的BM样本过表达。然而，当考虑到免疫分型时，miR-708-5p仅在Pre-B-ALL中过表达；在Pre-B-ALL患者中，miR-708-5p表达水平与对照组相当；在T-ALL患者中的表达量显著低于对照组[19]。实验中我们采集到了79例Pre-B-ALL儿童血样和11例T-ALL儿童血样，并通过qRT-PCR检测和箱型图分析得到miR-708在儿童ALL中显著下调，研究结果与其他学者相一致。

本研究的优点在于，基于前人的研究成果深入探究了miR-708在儿童ALL中的诊断和预后意义。我们的研究结果表明，ROC曲线下面积为0.882，敏感度为92.2%，特异性为80.0%，说明miR-708在儿童ALL中具有良好的诊断潜力，并且敏感度和特异性较高；约登指数为0.722，说明以miR-708作为筛选条件来辨别患者与非患者的总能力较高。无进展生存期曲线显示miR-708高表达组的复发率显著高于低表达组，并且低表达组患者的无进展生存期显著比高表达组的患者延长；总生存期曲线显示miR-708低表达组预后效果显著高于miR-708低表达组。但由于本次研究的样本量较少，使得miR-708在儿童ALL中的表达量的精确度有待提高。在以后的研究中还应加大样本量，使其在儿童ALL中的诊断和预后价值更为准确可信。

综上所述，miR-708可以在临床上作为儿童急性淋巴细胞白血病诊断和预后的生物标志物。