头颈鳞癌预后相关差异表达LncRNAs 的筛选、ceRNA网络构建及生物学功能预测

吴丽芷，申丽君，黄茂凌，祁承林，杨蕊，盛建飞，陈始明

武汉大学人民医院，武汉430060

头颈鳞癌（HNSCC）主要由舌癌、口腔癌、喉癌及鼻咽癌组成，是头颈部最常见的恶性肿瘤［1］。目前大多数HNSCC 患者的临床结局及长期生存率仍不高，5 年生存率为50%～60%［2］。因此，深入了解HNSCC 发生的分子机制并开辟特异的靶向治疗具有十分重要意义。长链非编码RNA（LncRNAs）是指长度超过200 个核苷酸的RNA 转录本，其不具备蛋白编码的潜力。随着高通量测序技术的发展，LncRNAs与包括恶性肿瘤在内的众多疾病的发病关系逐渐被认识［3］。越来越多的证据表明，LncRNAs在癌症的发生和发展中起着关键作用，如lncRNA BANCR在胃癌中高表达并与患者低生存率相关［4］。

近年研究表明，与其他恶性肿瘤相似，LncRNA和microRNAs（miRNAs）之间的相互作用也发生在HNSCC 中，并且其下游的一些靶基因已被证实与肿瘤的发生和发展密切相关。根据竞争性内源性RNA（ceRNA）假说［5］，ceRNAs 通过竞争相同的miRNAs 响应元件［6］与mRNAs 进行通信。越来越多的研究发现，LncRNAs 作为ceRNAs 在HNSCC 的发生发展过程中发挥着重要作用［7］。2005年启动的癌症基因组图谱（TCGA）项目已经生成33 种癌症关键基因组变化的全面、多维的图谱，收集了11 000多例患者的相关临床数据。为数据挖掘和潜在生物标志物的识别提供了丰富的资源［8］。目前，LncRNA 与HNSCC的关系仍无定论。

本研究利用TCGA 中HNSCC 患者LncRNAs 测序数据，筛选出HNSCC 组织与对照组织中差异LncRNAs，并选出了有诊断价值且未被报道过的候选LncRNA，同时以候选LncRNA 为中心构建了ceRNA调控网络，并预测了其生物学功能。

1 材料与方法

1.1 数据来源 TCGA 数据库（https：//cancerge‑nome.nih.gov/）；STRING 数据库（http：//string-db.org/cgi/input.pl）；David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）；Kaplan-Meier 数据库（http：//kmplot.com/anal‑ysis/）。

1.2 HNSCC 组织中候选LncRNA 筛选及其与患者预后关系的验证 从TCGA 数据库下载HNSCC Ln‑cRNA 数据及临床信息。数据库中收录502 例份HNSCC 组织样本和44 例份邻近正常组织样本。使用R 语言“degeR”包根据P<0.05 和|log2FC|>1.0 筛选HNSCC 组织及正常组织样本中差异的LncRNA，即为差异表达基因（DEGs），鉴别差异表达LncRNAs的详细步骤参考Sui 等［9］的研究报道。利用Kaplan-Meier Plotter 数据库对差异表达LncRNAs 生存分布进行可视化，选出有诊断价值潜力的候选Ln‑cRNAs。基于TCGA-HNSCC 数据集，比较正常组织与HNSCC 组织候选LncRNAs 的差异以及候选Ln‑cRNAs 高、低表达者的生存时间差异。采用接受者—操作特征（ROC）曲线下面积评估LncRNAs对HN‑SCC 的诊断价值（1 表示完全判别值，0.5 或更少表示无判别值）。

1.3 候选LncRNA 的ceRNA 网络构建 通过star‑Base v3.0 筛选出与HOXA11-AS 相关的miRNAs，之后在oncomir 在线软件上查找出差异miRNAs，通过对比找出HOXA11-AS相关的差异miRNAs。再次通过starBase v3.0 按照：Sites≥5，CancerNum≥10 的条件筛选出miRNAs 相关的mRNAs，而后又通过on‑comir 筛选miRNAs 相关的mRNAs。最后利用Cyto‑scape v3.5.1绘制HOXA11-AS介导的ceRNA网络。

1.4 候选LncRNA 的生物学功能分析 使用DA‑VID 数据库对候选LncRNA 进行基因本体功能（GO）和KEGG 通路分析，显著性水平P<0.05，富集分数>1.5［9］。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以表示，比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNSCC 组织中候选LncRNA 及其与患者预后关系的验证 筛选出HNSCC 组织与正常组织差异表达的LncRNAs 有129 个，其中65 个下调表达，64个上调表达。Kaplan-Meier Plotter 在线网站对候选的差异表达LncRNAs 生存分布进行可视化结果显示，14 个上调表达、11 个下调表达的LncRNAs 患者生存曲线差异有统计学意义，最后筛选出较有潜力且未被报道的LncRNA HOXA11-AS 作为候选Ln‑cRNA。

基于TCGA-HNSCC 数据集，与相邻正常组织相比，HNSCC 组织中HOXA11-AS 的表达水平均升高（P<0.05）（图1），HOXA11-AS 的ROC 曲线下面积（AUC）为0.9031。与HOXA11-AS低表达HNSCC 患者比较，HOXA11-AS 高表达HNSCC 患者的生存时间更短（n=499，P=0.011<0.05）（图2）。

图1 基于TCGA数据库数据HNSCC组织及癌旁组织中HOXA11-AS的表达水平

图2 HOXA11-AS高、低表达者的生存曲线比较

2.2 HOXA11-AS-miRNA-mRNA 网络 找出4 个HOXA11-AS 相关的差异miRNAs（hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-301b和hsa-miR-454-3p），4 个miRNAs 相关的mRNAs 有9 个下调（AC‑SL1、FYCO1、CPEB4、CPEB3、KAT2B、SASH1、PRUNE2、NCOA4、PDLIM3）和3 个 上 调（PML、ANKRD29、EDIL4））。HOXA11-AS介导的ceRNA网络见图3。

2.3 HOXA11-AS 的生物学功能 HOXA11-AS 主要参与的生物学功能为细胞对各种生物刺激的反应，包括细胞对内源性刺激的反应、对信使核糖核酸蛋白复合物和细胞质翻译的负调控等。KEGG通路共有15条，主要涉及背腹轴形成和孕酮介导的卵母细胞成熟等与生殖相关的通路、脂肪代谢相关通路和癌症相关通路（P<0.05）。

3 讨论

图3 HOXA11-AS介导的ceRNA调控网络

HNSCC 的发生发展是癌基因和抑癌基因共同作用的结果，其机制复杂，目前尚缺乏有效实用的分子标志［10，11］。近年来，包括LncRNAs 和miRNAs 在内已陆续有多个分子标志物被报道与HNSCC 有关［12］。其中研究最广泛的LncRNAs 有RHPN1-AS1、WWTR1-AS1 和HOTAIR［13-15］。它们参与了许多重要的细胞过程，如增殖、凋亡、侵袭、转移等。例如，RHPN1-AS1 在HSNCC 患者中显著高表达，敲低RHPN1-AS1 可抑制HNSCC 中肿瘤细胞的增殖和侵袭转移能力［13］。

本研究通过分析TCGA 数据库发现HOXA11-AS 在HNSCC 中显著高表达，且其表达与患者的预后呈明显的负相关，初步提示其为致癌因素。HOXA11-AS 在恶性肿瘤中异常表达及其可能的作用已引起了学者们的关注。GUO 等［16］发现，肝细胞癌干细胞中HOXA11-AS 高表达；抑制HOXA11-AS表达可抑制其在体内的自我更新、增殖、迁移和致瘤性。BAI 等［17］发 现，在 非 小 细 胞 肺 癌 组 织 中HOXA11-AS 表达明显上调，抑制HOXA11-AS 可通过增加miR-148a-3p 的表达来抑制肺癌细胞的增殖并促进癌细胞凋亡。LIU 等［18］则证实HOXA11-AS的上调与胃癌肿瘤大小、TNM 分期和淋巴结转移呈正相关，HOXA11-AS 通过SRSF1来提高胃癌细胞的增殖和侵袭能力。

虽然HOXA11-AS 与其他肿瘤的发病特别是某些腺癌发生的关系已有大致了解，但它如何影响HNSCC 的发生尚不清楚。越来越多的研究表明Ln‑cRNAs 参与了ceRNA 网络调控，并且LncRNAs 可作为miRNA 诱饵调控基因表达。不同类型的恶性肿瘤，如直肠癌［19］、乳腺癌［20］，都建立了相应的ceRNA网络模型。鉴于此，本研究按照特定标准构建了HOXA11-AS 介导的HOXA11-AS - DEmiRNAs -DEmRNAs ceRNA 网络，从理论上探讨HOXA11-AS影响HNSCC 发生的可能途径。本研究发现，HOXA11-AS 可 直 接 作 用 于4 个DEmiRNAs（hsamiR-130b-3p，hsa-miR-301a-3p，hsa-miR-301b，hsamiR-454-3p），通 过DEmiRNAs 间 接 作 用 于12 个DEmRNAs。miR-130b-3p 可通过 直 接靶向Notch 配体Delta-like 1（DLL1）来抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。hsa-miR-301a-3p 可促进结直肠癌的生长及肝转移，其靶基因为DLC-1 和RUNX3。目前hsamiR-301b 和hsa-miR-454-3p 与肿瘤关系的报道尚少；尚未发现这四种DEmiRNAs 与HNSCC 相关的报道。因此，本研究发现的这4 个DEmiRNAs 与HN‑SCC的发病关系值得深入探讨。此外，本研究发现，HOXA11-AS 的生物学功能主要有细胞对各种生物刺激的反应（细胞对内源性刺激的反应、对信使核糖核酸蛋白复合物和细胞质翻译的负调控），相关的通路主要有背腹轴形成、孕酮介导的卵母细胞成熟、脂肪酸生物合成和癌症相关通路。

总之，本研究成功筛选出了HNSCC 预后相关的LncRNA（HOXA11-AS），构建了HOXA11-AS 介导的ceRNA调控网络；并发现HOXA11-AS主要参与细胞对各种生物刺激的反应等生物学功能，涉及的信号通路主要有背腹轴形成和孕酮介导的卵母细胞成熟等与生殖相关的通路、脂肪代谢相关通路和癌症相关通路等。