蛋白质-蛋白质相互作用的实验检测方法

孔文娜 周 宓 林海霞 王任小

(1.上海大学理学院, 上海 200444;2.中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室, 上海 200032)

蛋白质是生命体的重要组成部分, 是生命活动的主要承担者和执行者.人类基因组由20 000∼30 000 个可编码超过50 万种不同蛋白质的基因组成[1].随着人类基因组计划的完成,旨在研究全基因组水平上所有蛋白质的表达、结构以及功能[2]的蛋白质组学已然成为后基因时代的研究热点.据估计, 超过80%的蛋白质并不是孤立存在, 而是与其他蛋白质通过相互作用形成稳定或瞬时的复合物结构[3].蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interactions,PPIs)是分子生物学中最重要的现象之一, 几乎在所有的生命过程如细胞通讯、代谢、转运、信号转导、免疫应答和基因转录中, 都起着核心作用.通过研究蛋白质-蛋白质相互作用, 可以探究蛋白质在生命过程中的作用以及发挥功能的机制, 更好地理解生命过程.因此, 对蛋白质-蛋白质相互作用的研究, 已成为生命科学研究的热点之一[4].

蛋白质-蛋白质相互作用是生物分子网络中的基本组成元件, 但是异常的蛋白质-蛋白质相互作用很有可能会导致肿瘤的发生和发展.因此, 蛋白质-蛋白质相互作用的位点也成为新兴的一类药物靶点, 例如G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)、核激素受体、离子通道和酶等[5].癌症、心血管疾病、免疫系统疾病等均有以靶向蛋白质-蛋白质相互作用的研究, 如细胞色素c-细胞色素c 氧化酶[6]、PD-1-PD-L1[7]、APE1-Ref-1[8]、MDM2—p53[9]等.因此, 研究PPIs 为开发治疗疾病的新药提供了更多机会[10].

随着蛋白质组学的飞速发展, 用于表征蛋白质-蛋白质相互作用的方法相继提出。比较传统的技术方法有荧光偏振、核磁共振、酵母双杂交和免疫共沉淀等.近年来新发展的方法包括生物膜干涉技术、微量热泳动(microscale thermophoresis, MST)技术、AlphaScreen 和蛋白质片段互补分析技术等.表1 中总结了9 种基于生物物理和生物化学原理, 并被广泛用于表征蛋白质-蛋白质相互作用的常用实验技术以及近年来发展的新检测方法.

表1 蛋白质相互作用方法的比较分析Table 1 Comparisons of methods for protein-protein interaction

1 基于生物物理原理的检测方法

1.1 表面等离子共振

表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)是一种基于物质间相互作用所导致芯片表面质量变化而产生的一种光学现象。目前, SPR 生物传感器已经广泛用于研究生物分子间的相互作用, 可以对蛋白质-蛋白质相互作用进行实时、无标记检测.SPR 的原理(见图1(a))是先将一种蛋白质分子通过共价结合或亲和捕获的方式固定在生物芯片表面, 再将待测分析物注入并流经芯片表面, 蛋白质分子间的结合会引起芯片表面质量增加, 从而导致表面折射率按同比例增强, 蛋白分子间反应的变化即被观察到, 这种变化用反应单位(reaction unit,RU)来衡量.传感器表面与待研究蛋白质之间的界面是传感器系统的重要组成部分, 一般购买商业芯片, 其中包括通过氨基偶联的CM5 芯片、用于固定His 标签蛋白的NTA 芯片和用于固定生物素化蛋白的SA 芯片.

图1 表征PPIs 的生物物理方法示意图Fig.1 Schematic diagrams of biophysics methods used to represent PPIs

与荧光或酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)相比, SPR 技术具有很多优点: ①测量基于折射率的变化, 分析物不需要任何标记, 可直接检测; ②测量可以实时进行, 研究人员能及时获得动力学数据和热力学数据; ③作为一种多功能技术, 能够检测各种分子量的蛋白质.基于以上特点, SPR 已成为研究生物分子间相互作用的有力工具[11].以MDM2-p53 的相互作用为例, Wu等[12]采用双通道SPR 传感器测定在肉瘤组织提取的游离态和与p53 结合的MDM2 的水平, 为了获得更高的灵敏度和特异性, 使用MDM2 特异单克隆抗体(2A10)识别游离态和与p53 结合的MDM2, 发现由肉瘤组织提取的游离态和总MDM2(游离和结合形式组合)蛋白质的浓度比正常组织提取的高, 并且与p53 结合的MDM2蛋白质仅占总MDM2 浓度的一小部分.但是, SPR 技术的缺点是难以区分实验过程中的非特异性吸附, 对实验结果造成影响.

传统的SPR 技术限于低通量研究, 因为标准SPR 生物传感器仅在单个传感器芯片上包含3∼4 个流动池.如今随着技术的革新, 表面等离子共振成像(surface plasmon resonance imaging, SPRI) 正在向高通量筛选(high-throughput screening, HTS)发展.结合蛋白质阵列技术和电荷耦合器件(charge-coupled device, CCD)相机, 并根据反射光的强度制作图像,SPRI 已经发展到能同时处理成千上万个样本[10,13].

1.2 生物膜干涉

生物膜干涉(biolayer interferometry, BLI)是近年来新发展起来的一种基于光干涉量度法的检测技术, 可用于实时、快速、以非标记方式分析生物分子之间的相互作用.BLI 技术(见图1(b))将相互作用的生物分子之一通过氨基偶联、生物素/链霉亲和素、组氨酸标签/镍离子螯合剂等方式固定于光纤制成的生物传感器末端, 形成生物膜层.当一束可见光垂直入射生物膜层时, 光在生物膜层的两个界面反射后形成一束能被光谱仪检测到的干涉光谱.当固定分子与溶液中的分析物发生相互作用时, 生物膜层厚度发生变化, 通过检测干涉现象的相位移动,从而能够分析结合到传感器上的分子数量的变化[14-15].

BLI 技术的应用十分广泛, 可以检测生物分子之间是否存在特异性结合.研究人员已将BLI 技术广泛用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究, 如Pogoutse等[16]利用BLI 技术测定两组蛋白质相互作用对Mms2/Ubc13、铁转蛋白/TbpB 间的结合常数.该工作采用了链霉亲和素固定的方式, 目标蛋白在体内实现生物素酰化过程, 随后以细胞裂解液取代纯化的蛋白, 通过BLI 测得结合常数, 既经济又省时.

BLI 技术具备实时监测、非标记、高通量、快速检测等优点, 可检测亲和力为10−10∼10−4mol/L 的相互作用, 并且可提供结合的亲和力KD值及动力学信息.相比表面等离子共振的微流控系统, BLI 技术侵入即读的检测手法更为简便, 且实验结果不受样品折射率影响,但是实验过程中需要注意分析物是否与生物膜层存在非特异结合.另外, 样品缓冲液中所包含的部分去垢剂可能形成非均匀胶束, 从而引起生物膜层非均匀性厚度变化, 对检测结果产生影响[15].

1.3 微量热泳动

MST 技术可以检测分子在微观温度梯度场中的定向运动, 因此也被称之为热泳动.定向运动现象对由结合引起的分子大小、电荷、构象或水化层的细微变化十分敏感, 因而可以用来研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用[17].MST 技术示意图见图1(c).实验过程中, 对相互作用的蛋白质分子其中之一进行荧光标记, 以溶液形式均匀分布于毛细管中.随后, 毛细管在红外激光照射下形成局部温度梯度, 标记分子因热泳动作用力而远离加热区域, 经历温度跃迁(T-jump)后达到稳定态.在关闭激光后, 标记分子经历逆向温度跃迁和反向扩散后, 恢复到均匀分布的状态[18-20].上述这一过程会受到由结合引起的分子大小、电荷或水化层变化的影响,因而通过逐步滴定与标记分子相互作用的蛋白质, MST 技术可用来测定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数[21-22].

MST 技术可以很容易地测量蛋白质结合的过程, 目前越来越多地应用于与疾病相关的蛋白质相互作用的研究中, 从而揭示疾病发生的分子机制.例如, 纤毛结构或者长度的失调会引发疾病.纤毛的前体微管蛋白(tubulin)在纤毛内运输与两个关键蛋白质IFT74 和IFT81有关.Bhogaraju等[23]利用MST 技术研究人类重组IFT81、IFT74 与牛的αβ-tubulin 之间的偶联特征, 实验发现IFT74/81 复合物比单独IFT81 与tubulin 的结合力大大增强, 证明了与tubulin 相偶联的模块是由IFT74/81 复合物组成, 而不是单独的IFT81.

MST 技术相比与其他体外结合实验的优势在于: ①样品无需固定处理; ②样品用量少,可对µL 级的溶液进行检测; ③对相对分子质量没有限制; ④可以进行快速检测, 结合活性实验可在10 min 内完成测定; ⑤可以测定pmol/L 级的亲和活性.此外, MST 技术可以对复杂的生物体系如细胞裂解液、血浆等进行测定[24].通常, MST 技术需要荧光团标记蛋白质分子.

2 基于生物化学原理的检测方法

2.1 荧光共振能量转移

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 是指荧光供体在受到激发光激发后不发射出光子而将激发的能量转移到荧光受体上的现象(见图2(a))[25].在对蛋白质-蛋白质相互作用的研究中, 分子间FRET 仅在荧光供体和受体相距非常近即形成复合物时发生.因此, 要产生FRET 现象需要满足3 个条件: ①供体发射光谱与受体激发光谱有重叠; ②荧光供体和受体之间的距离在10 nmol/L 范围内; ③供体与受体之间迁移偶极子的方向平行.目前, 广泛用于供体与受体标记的荧光染料来自于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的变异体, 包括青色荧光蛋白-黄色荧光蛋白(cyan fluorescent protein-yellow fluorescent protein, CFP-YFP)[26]、蓝色荧光蛋白-GFP(blue fluorescent protein-GFP, BFP-GFP)[27]、CyPet-Ypet[28]、MiCy-mKO[29]、CrFP-YFP[30]等.随着对FRET 方法的优化, 该技术已被广泛应用于体外测定结合活性并筛选蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂[10,31].蛋白被小型泛素样修饰物(small ubiquitin-like modifier, SUMO)修饰是真核生物界的重要修饰途径.SUMO可以组装成聚合链, 与包含两个SUMO 相互作用基序(SUMO-interaction motif, SIM)的受体蛋白质相结合, 从而对受体蛋白质进行修饰.Kost等[32]设计了一种FRET 传感器, 用于测定SUMO 线型二聚体与包含SIM 蛋白质的结合,利用马来酰亚胺和铜催化的点击化学反应将合成受体和供体的染料偶联到SUMO 亚基上, 在多个SIM 配体存在的情况下监测FRET 变化.因此,开发FRET 传感器对于研究SUMO-SIM的相互作用具有非常重要的价值.

图2 表征PPIs 的生物化学方法示意图Fig.2 Schematic diagram of biochemical methods used to represent PPIs

结合显微成像技术的FRET 可对活细胞内两个蛋白质分子间相互作用进行实时观察和定量测定, 具有非常高的时空分辨率.然而, 由于FRET 显微镜依赖于从蛋白质-蛋白质相互作用中收集荧光信号, 因此它具有一些缺点, 包括自发荧光、检测器噪声、光学噪声干扰等.FRET技术也可与流式细胞仪联用.Mahajan等[33]利用FRET 与流式细胞仪相结合, 研究酵母细胞中蛋白质-蛋白质相互作用, 在短时间内分析大量细胞, 在统计学上产生比显微镜技术更强大的结果.

2.2 AlphaScreen 技术

AlphaScreen 技术及AlphaLISA 技术都是利用作为供体和受体的微珠来检测生物分子间的相互作用.这一方法(见图2(b))的关键组分为直径为250∼350 nm, 并分别被不同官能团包裹的供体微珠和受体微珠, 它们分别作为光敏剂和化学发光单元.在PPIs 的研究中, 在波长为680 nm 的激光照射下, 两个目标蛋白质的相互作用会将供体微珠和受体微珠拉近, 其中供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气激发为活泼的单线态氧, 单线态氧扩散至受体微珠, 并与受体微珠上的化学发光剂反应, 进一步激活了受体微珠上的荧光基团, 使之发出520∼620 nm 的荧光, 从而被检测[34-35].

AlphaScreen 技术可应用于复杂的蛋白质之间的相互作用, 包括配体与GPCR 结合[36]、激酶与底物结合[37]、生长因子与受体的结合[38]以及转录因子同激活子或抑制子[39]之间的相互作用等.分选蛋白(sorting nexin, SNX) 在真核生物膜转运功能调节上具有重要的作用,Sierecki等[40]利用AlphaScreen 方法研究了含有BAR 结构域的分选蛋白(SNX-BAR)家族中的PPIs 与蛋白质同源二聚和异源二聚现象之间的联系, 检测了144 对可能存在的PPIs, 最终发现9 种SNX-BAR 蛋白质间相互作用对同源二聚现象有重要调节作用, 7 种蛋白质相互作用对与异源二聚现象有重要联系.

AlphaScreen 是一种多功能且灵敏度高的技术, 可进行高通量筛选[41].相比于其他技术,AlphaScreen 具有以下优势: ①对比能量传输距离为10 nm 的FRET 技术, AlphaScreen 为200 nm, 可以研究更大范围的分析物, 如全长的蛋白质或免疫复合物; ②具有更大的亲和力检测范围,KD值范围可以从pmol/L 到mmol/L.但是, 每种类型的微珠都有一定的容量, 过量的靶蛋白会使供体微珠或受体微珠过饱和并抑制它们的结合, 导致信号减弱.因此, 事先进行交叉滴定分析来确定合适的蛋白浓度对于AlphaScreen 方法是必不可少的.

2.3 蛋白质片段互补分析

蛋白质片段互补分析(protein-fragment complementation assay, PCA)技术是近年来发展起来的一种研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要策略之一, 可以在体内外动态地观察活细胞、器官, 甚至个体水平蛋白质间的相互作用[42], 也可以实时定量动态反映复合物的组装与解离过程.PCA 技术的原理(见图2(c))是将某个功能蛋白质切成两段, 分别与两种兴趣蛋白质相连形成两个融合蛋白质, 若两个兴趣蛋白质存在相互作用使得两个功能蛋白质片段相互靠近, 互补并重建功能蛋白质的活性, 通过检测功能蛋白质的活性进而判断兴趣蛋白质间的相互作用关系.在PCA 体系中功能蛋白质的两个片段相互融合即形成报告蛋白.目前,PCA 所使用的报告蛋白包括二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)[43]、β-内酰胺酶(β-lactamase)[44]、GFP[45]和荧光素酶[46]等.PCA 技术的优点是具有高灵敏度、可定量检测、可进行高通量筛选, 缺点是融合蛋白的使用有可能会改变兴趣蛋白的折叠和结构.

基于DHFR 的PCA 方法的原理是DHFR 可以催化二氢叶酸还原成四氢叶酸, 四氢叶酸对细胞的生长和增殖至关重要, 缺失会致死, 因此DHFR 成为极佳的报告蛋白(report protein)应用于PCA 的研究.这种简单的生存选择测定法被广泛用作大规模分析的系统方法.Rochette等[47]利用DHFR-PCA 的方法研究酵母全局组织的PPIs 网络对于环境扰动的响应,高通量筛选了正常状态和药物诱导DNA 损伤两种情况下的1 000 多种PPIs, 最终发现156 种PPIs 在对DNA 损伤响应的调节中具有重要作用.

基于荧光蛋白质的PCA 方法也称为双分子荧光互补(bimolecular fluorescent complimentary, BiFC), 由于发色团的形成不可逆, 该方法更有利于捕获蛋白质间的弱相互作用, 并且能够在高空间分辨率的条件下直接观察到生物体和各种细胞类型的任何亚细胞区室中的PPIs.新发展的GFP 三裂法, 可以最大程度避免传统分裂GFP 方法中遇到的聚集和折叠干扰问题[48].但是与其他报告蛋白相比, 基于荧光蛋白的PCA 不适用于定量化研究,仅能作为定性研究.BiFC 技术最大的缺陷是对温度敏感, 当温度高时, 片段间不易互补形成完整的荧光蛋白.

2.4 亲和层析

亲和层析(affinity chromatography, AC)一般指亲和色谱.亲和色谱法是常见的蛋白质-蛋白质相互作用研究方法, 它是基于蛋白质分子之间高度特异性相互作用将特定蛋白质从复杂的混合物中分离纯化出来[10].这种方法极大地提高了蛋白质纯化效率, 为蛋白质-蛋白相互作用研究提供技术平台.亲和色谱法包括拉下法、串联亲和纯化和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)法等.

(1) 拉下(pull-down)法.拉下法是研究蛋白质-蛋白质相互作用强大技术之一, 原理是将GST 融合的诱饵蛋白质固定在谷胱甘肽固相载体上, 用以捕获与之相互作用的目标蛋白质,然后洗脱结合物并通过SDS-PAGE 电泳分析鉴定(见图2(d)).拉下法可用于研究可疑或未知的PPI.Luo等[49]对拉下法进行改进, 提出一步胰蛋白酶裂解洗脱法来研究鸟苷三磷酸酶(GTPase)Rab31 与EEA1 间的相互作用, 有效地减少假阳性和假阴性现象.Schulte等[50]研究了一种SINBAD 微型拉下法用于检测PPI, 通过荧光显微镜观察单个亲和层析磁珠表面亲和标记的兴趣蛋白质与不同颜色量子点标记的蛋白质之间的结合, 这种方法可以同时分析多组PPIs, 减少实验所需的时间和材料.

(2) 串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)法.TAP 法采用两步亲和纯化(见图2(e)), 能够快速研究在生理条件下蛋白质的相互作用.TAP 法可以提高特异性, 有效减少非特异性结合, 大大降低结果的假阳性率.例如, 鼠伤寒沙门氏菌通过三型分泌系统(type 3 secretion system, T3SS)向宿主传递效应蛋白质SopA, 刺激肠上皮引发炎症反应.Kamanova等[51]在SopA 上融合表达GST 和flag 两个标签, 通过TAP 体外纯化, 质谱分析鉴定, 确定与SopA 相互作用的两个E3 泛素连接酶TRIM56 和TRIM65.进一步研究发现,SopA 与这两个蛋白质结合后, 通过两个先天免疫受体MDA5 和RIG-Ⅰ来刺激宿主的免疫信号.这一研究揭示了沙门氏菌可以通过直接作用于宿主先天免疫信号通路来调节免疫反应的沙门氏菌作用机制.但是, TAP 法不容易检测到弱的蛋白质-蛋白质的相互作用.

(3) Co-IP 法.免疫共沉淀法被广泛应用于PPIs 的研究中, 是确定生理状态下细胞内PPI 的有效方法.其原理是以抗原抗体之间的专一性为基础, 将蛋白质复合物沉淀在固相载体上, 再通过蛋白质变性分离, 检测结合蛋白质, 进而证明蛋白质间的相互作用(见图2(f)).Co-IP 方法研究自然状态下的PPI, 避免人为干扰, 可信度高, 但不易检测亲和力较弱的PPIs.Fedosejevs等[52]利用该技术研究在蓖麻油籽中SUS 与RGP 间的相互作用, 使用抗体蔗糖合酶1(sucrose synthase-1, RcSUS 1)免疫沉淀蛋白质复合物RcSUS 1 和RcRGP 1, 通过鉴定确定RcSUS 1 与RcRGP 1 间存在明显相互作用, 进而证明了在植物的发育种子和根中SUS与RGP 通过相互作用, 促进源自蔗糖的UDP-葡萄糖用于半纤维素和糖蛋白的生物合成, 为SUS-RGP 代谢物提供证据.这一结果有助于更好理解种子中碳代谢和光合产物的分配, 在代谢工程中具有潜在应用价值.

3 结束语

近年来表征蛋白质-蛋白质相互作用的新技术、新方法不断涌现, 并向高灵敏度、高通量的方向发展.根据研究目标的不同以及蛋白质自身的特点, 选择合理的检测方法十分重要.若要定性表征蛋白质分子间是否存在相互作用, 可以选择传统的拉下法、TAP、Co-IP 等方法进行检测; 若要定量测量蛋白质分子间的相互作用, 可以选择MST, SPR, PLI 等方法进行检测;若要进行高通量的研究, 可以选择FRET, AlphaScreen, PCA 等方法进行检测.所有方法都有其自身的局限性, 可能在检测中出现假阳性或假阴性的结果.因此, 应该使用基于不同原理的技术方法相互验证, 以获得更为可靠的结果.同时, 不同技术方法的联用可弥补单种技术的不足.例如, 借助质谱的高灵敏度、高通量的优势, 亲和层析可以与质谱(mass spectroscopy,MS)联用(即AP-MS)鉴定与目标蛋白质相互作用的蛋白质, 以获得更完整的信息.随着技术方法的持续进步, 在蛋白质-蛋白质相互作用研究领域将会更广泛地应用上述技术.预计检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术将向高通量方向发展, 并将会产生大量的实验数据, 因此需要发展更强大的生物信息处理工具将原始数据转化成有用的信息.