3种抑菌剂对葡萄叶片霜霉病的影响差异分析

李戌彦，葛亚琪，杨忠义，张 霁，庞富强，孙玉荣，王梓皓，和宇亭，纪 薇

（山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801）

葡萄（Vitis spp.）是世界四大水果之一，在多地均有栽植，2019 年全球产量达2 220.0 万t[1]。由于葡萄有较强适应性，同时含有多种微量元素，可用于鲜食、酿酒、制干等各个行业，产生的经济效益高，在我国被广泛种植。现在山西省葡萄种植产业已经初具规模，在全国葡萄产业中，山西葡萄种植的面积和产量都位居前列。葡萄霜霉病（Plasmopara Viticola（Berk et Curt.）Berl.Et de Toni）是葡萄种植过程中最严重的病害之一，作为一种典型的单年流行病害，其在田间潜在发育期短，发病迅速[2]，病菌以卵孢子的形式在土中越冬，待第2 年春天外界条件合适时，卵孢子萌发会产生孢子囊和游动孢子，通过空气传播进入气孔，经过一段潜育期后孢子囊进行再侵染[3]。在葡萄生长期，病菌可不断侵染，只要气候条件适宜，病菌就会大面积发生，造成严重后果[4]。

自1882 年MIRA 研制出的波尔多液杀菌剂在防治葡萄霜霉病方面取得了一定成效以来，人们虽然不断改进化学农药，并提高管理技术，但是仍然存在一些不足和弊端[5]。在实际生产中，防治主要还是以施用化学药剂为主，但是化学农药是非特异性的，杀死病菌的同时，还会有药物残留在葡萄果实表面，对环境污染极大，也会使益虫遭受毒害[6-7]。随着科技进步和人们生活水平的提高，采用生物菌剂作为霜霉病防治方法已经广泛被葡萄生产行业所接受。利用生物菌剂来抑制葡萄霜霉病的方法无污染，安全有效，符合生态农业和绿色食品的农业发展趋势。植物受到外界病原体的入侵后，自身会产生相应的抗病反应，并且通过复杂的生理生化效应保护自身[8]。葡萄受到霜霉病侵染并激活抗病机制后，会产生相应的病程相关蛋白，其中，过氧化物酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）作为关键的病程相关蛋白，是植物细胞低于活性氧伤害的主要蛋白，其酶活性的高低可以反映植株抗病性的强弱[9-10]。

在前期大量调查研究的基础上，本研究选用益生菌生物菌剂、多粘类芽孢杆菌生物菌剂和枯草芽孢杆菌生物菌剂进行葡萄霜霉病的防治试验，通过对葡萄叶片分别喷施3 种生物菌剂后，接种葡萄霜霉病孢子，观察葡萄叶片发病情况，并测定SOD 和CAT 活性，研究3 种生物菌剂对葡萄霜霉病的抑菌作用，以期选出效果最佳的生物菌剂，为葡萄霜霉病防治和研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验对象 供试葡萄品种选用5 年生的克瑞森无核葡萄，取自山西农业大学园艺试验站（37°25′21″N，112°34′45″E），葡萄采用常规管理。

1.1.2 供试药剂 益生菌生物菌剂（山西大山宏涛环保科技有限公司）、多粘类芽孢杆菌生物菌剂（武汉科诺生物科技股份有限公司）、枯草芽孢杆菌生物菌剂（武汉科诺生物科技股份有限公司）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过氧化氢等购自天津天力化学试剂有限公司；核黄素及甲硫氨酸等购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 紫外分光光度计（UV-2450，岛津）、离心机（5430R，Eppendorf）、体视显微镜（SZX16，奥林巴斯）、显微镜（CX12，奥林巴斯）。

1.2 试验方法

1.2.1 霜霉病病菌的制备 从田间采集3～4 片感染霜霉病的克瑞森无核葡萄叶片，用无菌水洗去叶片表面杂质和葡萄霜霉病孢子囊后，将叶片背面朝上放在垫有湿润滤纸的培养皿中，于20 ℃恒温保湿培养；待新的霜霉菌孢子囊形成后，用毛刷轻轻刷下孢子囊，制成孢子悬浮液，并利用显微镜和血细胞计数板计算、调整孢子悬浮液浓度至1.6×105个/mL，存入4 ℃冰箱，备用[11-12]。

1.2.2 生物菌剂预处理 选取长势中庸一致的树体，分别从植株上部、中部、下部采取正常无病的克瑞森无核葡萄嫩叶8～10 片，无菌水冲洗后用直径1.5 cm 打孔器避开叶脉均匀打孔，将打下的叶盘正面朝下摆放在垫有湿润滤纸的培养皿中，备用[13]。根据使用说明书将多粘类芽孢杆菌、益生菌和枯草芽孢杆菌3 种生物菌剂稀释后分别喷施在叶盘上，以喷施等量蒸馏水为对照，共4 个处理，每个处理进行3 组重复，每组20 个叶盘；喷施处理24 h 后，在叶盘中央接种20 μL 霜霉病孢子悬浮液；待24 h后将叶盘表面多余菌液用滤纸吸干，20 ℃恒温保湿培养[14]。

1.2.3 培养观察 开始培养后分别在1、3、5、7 d 后观察记录各处理葡萄叶盘发病情况，发病后挑取菌落在显微镜下观察霜霉病形态，并在体式显微镜下观察霜霉病侵染情况。其中，叶片表面长出白色菌丝则记为感染，褐化面积超过70%则记为死亡。

1.2.4 SOD 及CAT 活性测定 培养7 d 时采集叶盘，参照曲敏等[15]和陈军等[16]的方法分别测定叶盘SOD 和CAT 活性。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0 进行数据处理及显著性分析；采用Microsoft Office 2019 进行图表的制作。

2 结果与分析

2.1 霜霉病菌的显微观察与确认

感染霜霉病后，叶片发生卷缩，背面出现不规则褐色斑点，并附着一层白色菌层（图1-A）；正面出现黄色病斑，感染严重部位发生褐化甚至干枯（图1-B）。挑取病叶背白色菌层，稀释后在显微镜下观察霜霉病孢子囊和孢子梗的形态，其中，孢子囊呈椭圆形或圆形，孢子梗呈圆柱状，顶端有凸起（图1-C）。人工接种葡萄霜霉病孢子，叶盘培养7 d后观察发现，部分叶盘感染了霜霉病（图1-D），在体视显微镜下观察发现，叶盘背面长出白色的霜霉，菌丝之间相互连接，菌丝略呈透明状，顶部孢子呈白色；同时观察还发现，叶盘上霜霉病孢子及孢子梗分布于病叶霜霉病相同，因而，确定通过接种培养，霜霉病侵染了叶盘。

2.2 不同生物菌剂防治霜霉病效果

从表1 可以看出，在叶盘接种试验中，随着时间推移，4 个试验组均有叶盘感染霜霉病，第7 天感病叶盘数量从高到低依次为喷施蒸馏水组＞喷施多粘类芽孢杆菌生物菌剂组＞喷施枯草芽孢杆菌生物菌剂组＞喷施益生菌生物菌剂组，且在培养过程中随着感染程度的加深，喷施蒸馏水组、喷施多粘类芽孢杆菌生物菌剂组、喷施益生菌生物菌剂组均有出现死亡。

第1 天、第3 天喷施多粘类芽孢杆菌生物菌剂组、喷施益生菌生物菌剂组和喷施枯草芽孢杆菌生物菌剂组叶片均正常，第7 天喷施蒸馏水组正常叶盘数仅为12.33 个，显著低于喷施益生菌生物菌剂组（16.33 个）与喷施枯草芽孢杆菌生物菌剂组（17.00 个）；3 个喷施生物菌剂组间正常叶盘数量差异不显著。在第7 天蒸馏水组、多粘类芽孢杆菌生物菌剂组、枯草芽孢杆菌生物菌剂组和益生菌生物菌剂组感染霜霉病的叶盘数目分别为4.67、4.33、3.00、2.00 个，死亡叶盘数目分别为3.00、1.00、0、1.67 个。

表1 不同生物菌剂处理后叶盘霜霉病发病叶盘数量统计结果 个

2.3 SOD 活性变化

从图2 可以看出，4 个处理下葡萄叶盘的SOD活性之间存在显著性差异，由高到低依次为喷施蒸馏水组＞喷施枯草芽孢杆菌生物菌剂组＞喷施益生菌生物菌剂组＞喷施多粘类芽孢杆菌生物菌剂组，其活性分别为30.01、22.71、22.47、15.62 U/g，其中，喷施蒸馏水组叶盘SOD 活性显著高于喷施多粘芽孢杆菌、喷施益生菌及喷施枯草芽孢杆菌。

2.4 CAT 活性变化

从图3 可以看出，不同处理下葡萄叶盘CAT活性由高到低依次为喷施蒸馏水组＞喷施益生菌生物菌剂组＞喷施多粘类芽孢杆菌生物菌剂组＞喷施枯草芽孢杆菌生物菌剂组，其活性分别为34.89、28.50、27.40、25.04 U/（g·min）。其中，喷施蒸馏水组叶盘CAT 活性显著高于其他3 组；喷施多粘芽孢杆菌生物菌剂组与喷施益生菌生物菌剂组和喷施枯草类芽孢杆菌生物菌剂组间叶盘CAT 活性差异不显著；喷施益生菌生物菌剂组叶盘CAT活性显著高于喷施枯草芽孢杆菌生物菌剂组。

3 结论与讨论

葡萄霜霉病是葡萄病害中较严重的一种，发病初期会使叶片干枯，严重时令果穗脱落影响产量，给葡萄种植户带来巨大损失。本研究发现，感染初期叶盘出现黄色斑点，后来颜色逐渐加深。从采集的感病叶片上刮下灰白色霜层，在显微镜下观察，可以看到病菌的孢子囊和孢子梗形态，其中，孢子囊呈椭圆形或圆形，孢子梗呈圆柱状，顶端有凸起，与刘旭等[17]对霜霉病孢子囊的形态观察结果一致。在叶盘培养过程中，感染霜霉病的叶盘背面长出白色霉层，在显微镜下观察叶盘菌丝，其形态特征和田间自然病叶上的霜霉病菌丝形态相同，与邵信儒等[18]对霜霉病菌丝的观察一致。

本研究利用叶盘培养法比较蒸馏水、多粘类芽孢杆菌生物菌剂、益生菌生物菌剂和枯草芽孢杆菌生物剂菌4 个处理对葡萄霜霉病防治效果，结果表明，与对照组相比，其他3 个试验组感病叶盘数量都有减少，与陈浩等[19]和扈进冬等[20]的试验结果一致。可以认为，喷施生物菌剂后葡萄感染霜霉病概率明显降低，其中，枯草芽孢杆菌生物菌剂防治霜霉病效果更好，验证了生物菌剂对于抑制葡萄霜霉病的良好效果。左瑞雨等[21]在研究中发现，多种芽孢杆菌的代谢产物具有很强的抗菌作用，对黄曲霉等菌类都有抑制作用。本研究中发现，枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌都会对霜霉病产生抑制作用，可能是因为这种代谢产物对霜霉病的繁殖起到了抑制作用。叶晶晶等[22]报道，枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌可以通过与病原菌进行营养竞争来抑制病菌发展，而本研究发现，益生菌与2 种芽孢杆菌的作用结果一致，也具有防治霜霉病的效果。本研究发现，在霜霉病侵染葡萄叶片3 d 时，喷施蒸馏水的叶盘已经开始出现感病叶片，但喷施生物菌剂的叶盘均未被感染，但5 d 时喷施菌剂的叶片也开始出现感染，可以看出，生物菌剂的持续效果至少在3 d 以上，在实际生产中可以在3～5 d 时进行第2 次用药。

霜霉病侵染叶片后，会导致蛋白质、核酸结构改变，与此同时，植物体内各种酶的数量和活性开始发生变化，以催化进行各种生理代谢反应，进行自我防卫[23]，其中，抗氧化酶可与病原菌发生相互作用，起到防止细胞被破坏，抵御病菌入侵的作用[24]。正常情况下，植物体内各种酶的含量与活性总是维持于一种动态平衡的状态，发生病菌侵染后，酶含量与活性就会发生变化。景岚等[25]研究发现，在植物受到病害侵染初期，植物抗氧化酶活性的变化可以表征植物抗病能力；陈亮等[26]通过研究发现，不同抗性西瓜品种在受到枯萎病菌侵染后，植物体内的SOD、CAT 活性均会升高，因而，可以用抗氧化酶活性的变化反映植物对病原物侵染的反应。

本研究发现，接种霜霉病孢子后，喷施多粘类芽孢杆菌、益生菌及枯草芽孢杆菌后叶盘的SOD活性都低于未接种菌剂叶盘的SOD 活性。喷施生物菌剂可以抑制霜霉病对叶片的侵染，而对照组由于霜霉病快速侵染和繁殖，迅速激活植物防御机制，因而SOD 活性升高。接种菌剂叶盘的CAT 活性显著低于对照组，因而推测喷施生物菌剂可以抑制霜霉病菌侵染植物叶片。刘丽等[27]通过研究不同抗霜霉病的葡萄发现，抗霜霉病品种防御机制更为敏感，在接种病菌后，保护酶活性上升快、增加多。本研究由于生物菌剂的施用，为植物叶片增加了一道防御，延长了内在抗氧化酶活性防御机制启动的时间，降低了其抗氧化酶活性。

目前，化学农药在农业生产中仍然有着重要作用，但化学农药的缺点也十分明显。近些年来，随着科学技术的发展，已经研制出一些生物菌剂来防治霜霉病，如枯草芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌等均具有较好的防治效果，且使用方法简单，在生产上应用也很普遍。本研究结果表明，益生菌、多粘类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌3 种生物菌剂对葡萄霜霉病都有较好的防治效果，综合比较发现，枯草芽孢杆菌生物菌剂对葡萄霜霉病抑菌效果最好，可根据当地气候条件和发病情况，在病害发生前期或初期连续喷施1～2 次枯草芽孢杆菌生物菌剂，以达到更好的防治效果。