北苍术根区土壤中AM真菌多样性及其与土壤养分相关性分析

李铭杰，周志杰，邢礼军，尹 鑫，武凤霞，刘建斌，邹国元*，张毅功，张淑彬*

（1. 河北农业大学资源与环境科学学院，保定 071001；2. 北京市农林科学院植物营养与资源研究所， 北京 100097；3. 河北承德市农林科学院药用植物研究所，承德 067000）

苍术为菊科苍术属多年生草本药用植物，以干燥的根茎入药，是我国中医药大宗药材之一[1]，有茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.) DC.和北苍术Atractylodes Chinensis（DC.）Koidz两种，北苍术主要分布于河北、内蒙古、黑龙江、山西、陕西、宁夏等省。近年来，野生北苍术被过度采挖导致资源日益枯竭[2]，为满足市场需求，人工栽培规模逐年增多，但由于种植不规范，造成其产量、药用成分含量不能达到理想效果，且病虫害问题频发。

丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌是陆地土壤中一类重要土壤有益真菌[3]，广泛存在各类生态系统中，如高原、平原、农田、沙漠、湿地、重金属污染区、盐碱地等。但不同生态系统中AM真菌优势群落组合存在差异，这些组合差异是宿主植物和生境环境共同作用的结果，也是其帮助植物适应不同生态系统的前提[4]，如改善植物营养状况[5]，增强宿主植物的抗旱性、抗盐渍性、抗病性[6-8]等。同时 AM真菌具有生态专性共生特性，不同植物对AM真菌有不同程度的菌根依赖性[9]，而且随真菌-植物组合而变化[10]。因此，研究宿主植物根区土壤AM真菌群落多样性和结构组成，对理解植物根区土壤微生态环境、结构与生态功能具有重要意义。

AM真菌丰富的寄主和生境多样性充分证明它们对不同生境类型的适应性[11]。国内学者基于AM真菌孢子形态鉴定和高通量测序，研究药用植物根区AM真菌物种多样性，发现药用植物AM真菌种质资源丰富。姜攀等[12]调查显示漳州地区20种常见药用植物根区有49种AM真菌资源，其中球囊霉属Glomusspp.是该地区的优势菌属。苏洋等[13]根据孢子的主要形态特征研究发现紫背天葵Begonia fimbristipulaHance根区土壤中AM真菌有26种，其中球囊霉属和无梗囊霉属Acaulosporaspp.为优势菌群。黄文丽[14]从全国20个采样点丹参Salvia miltiorrhizaBge土壤样品中检测到2属27种AM真菌，球囊霉属16种，无梗囊属11种，这两属是丹参根系土壤中AM真菌优势种群。曹敏等[15]采用高通量测序技术分析发现重庆地区茅苍术根际土壤AM有球囊菌门3纲4目8科9属，其中球囊霉属相对丰度最高，达到67%。可见在不同药用植物根际土壤中AM真菌物种资源不仅丰富，而且其优势AM真菌物种也存在差异。

本研究采用高通量测序技术，分析了河北承德道地产区药材北苍术野生与栽培土壤AM真菌多样性和丰度，了解该地区北苍术根区土壤AM真菌群落结构，旨在揭示野生与栽培北苍术根区AM真菌多样性及优势菌群差异，有助于筛选优势土著AM真菌，为AM真菌在北苍术仿野生人工栽培的应用提供了重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年 7月，在河北省北苍术道地产区承德宽城人工栽培基地（40°35′52.4″ N，118°30′54.2″ E）选取栽培一年、两年、三年的北苍术，在野生北苍术分布密集的承德隆化（40°58′26.5″ N，118°02′37.3″ E）分别采集栽培和野生北苍术根区土壤和根系样品，样品编号为栽培一年 N1、栽培两年 N2、栽培三年 N3、野生北苍术N4。在选取的采样区内随机设置3个采样点，每个采样点随机选取3株北苍术，去掉地表杂草、大块砂石等杂物，用酒精消毒过的干净铁锹沿着北苍术植物周围往下挖，尽量将整株植物根系挖出，连根带土放入塑料袋中并抖落根系粘附的土壤，将3株北苍术根区土全部混合均匀后取出约1 kg放入封口袋中，将3株植物根系放入另一封口袋中，带回实验室处理。土壤混匀后，取一部分土样于-20 ℃冰箱保存，用于测定AM真菌多样性，剩余土壤置于室温通风处风干，用于测定土壤理化性质。同时挑出并收集新鲜的北苍术须根系，用清水冲洗干净，剪成1～2 cm根段，放入FAA固定液（甲醛:冰醋酸:50%乙醇=13:5:20）中固定，用于测定与观察AM真菌侵染状况。

1.2 土壤养分状况分析

参考《土壤农化分析》[16]测定土壤的养分，其中土壤pH值用雷磁PHS-3C型pH计测定，碱解氮采用碱解-扩散法测定，速效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，速效钾采用乙酸铵-火焰光度计法测定，有机质采用重铬酸钾法测定，微量元素采用微波消煮-ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）法测定。

1.3 北苍术根系中AM真菌侵染测定与观察

取出固定后的北苍术须根系，清水冲洗干净，控干水分，采用墨水醋染色法[17]对根系样品进行染色并测定AM真菌侵染率。从染色后的北苍术根段中，随机挑选30个根段，制片并镜检。根据根段中菌根侵染强度分级标准和丛枝丰度分级标准对每条根段进行分级[18,19]，把每条根段的分级输入“MYCOCALC”软件，计算菌根侵染参数侵染频度F、侵染强度M和丛枝丰度A。侵染频度F（%）＝（侵染根段数/镜检总根段数）×100；侵染强度 M(%)＝（0.95×n5＋0.7×n4＋0.30×n3＋0.05×n2＋0.01×n1）/镜检总根段数×100，其中0.95、0.7、0.3、0.05和0.01分别代表各级所占的权重，n5、n4、n3、n2、n1分别代表各级根段数之和；丛枝丰度A（%）＝（0.1×mA1＋0.5×mA2＋1×mA3）×M。其中0.1、0.5和1分别代表各级所占的权重，mA1、mA2和mA3分别是A1、A2和A3各级根段对应的侵染根段菌根侵染强度，如mA3＝（0.95n5A3＋0.7n4A3＋0.3n3A3＋0.05n2A3＋0.01n1A3）/侵染根段数×100/m，m＝M×镜检总根段数/侵染根段数，mA2和mA1同上，A3、A2和A1分别代表各级根段数之和。

1.4 土壤总DNA提取及PCR扩增

采用土壤DNA提取试剂盒（FastDNA® Spin Kit for Soil）提取总DNA。运用巢式PCR扩增方法，选取AM真菌特异性引物AML1和AML2[20]为第一对引物，以及AMV4.5NF和AMDGR[21]为第二对引物扩增18S rDNA 基因部分片段。PCR 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物，利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序，委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.5 数据统计与分析

使用FLASH、Fastp软件对原始序列进行数据去杂和质量过滤。数据处理和分析采用上海美吉生物医药科技有限公司I-sanger云平台提供的数据处理软件完成。基于Usearch（7.0）软件平台对得到高质量序列，按照97%相似度对操作分类单元（Operational taxonomic units，OTU）进行聚类，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU序列进行分类学分析，使用BLAST比对maarjam/AM分类学数据库。基于 OTU 聚类和注释的结果，在美吉云平台中分析并绘制稀释性曲线、Venn图和群落组成分析图，进行Alpha（α）多样性指数的计算以及采用典范对应分析（CCA）进行土壤理化性质与AM真菌群落结构的相关性分析。其他数据分析和作图利用SPSS 22.0和Microsoft Excel 2016软件完成。

2 结果与分析

2.1 北苍术根区土壤养分状况

从河北承德北苍术的根区土壤有效磷水平可见，栽培3年北苍术土壤有效磷含量最高，野生及栽培一年土壤中磷含量最低。野生北苍术根区土壤有效钾含量最高。野生北苍术的土壤有机质含量最高，且显著高于栽培北苍术根区土壤。北苍术根区土壤碱解氮含量野生与不同栽培年间无差异（表1）。

表1 栽培与野生北苍术根区土壤大量元素含量Table 1 The content of macroelements in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis

由表2可知，野生北苍术根区土壤铁、铜含量与不同栽培时间的北苍术间无显著差异，锰含量显著高于栽培二、三年北苍术，但低于栽培一年北苍术，锌含量显著低于各个栽培时间的北苍术，硼含量均高于栽培北苍术，但与栽培三年的北苍术无显著差异。

表2 栽培与野生北苍术根区土壤微量元素含量Table 2 The content of trace elements in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis

2.2 北苍术根系AM真菌侵染状况

由表3可知，北苍术根系均可观测到AM真菌的侵染，侵染频度为100%，但野生和栽培北苍术根系中AM真菌形成菌根侵染强度（M%）和丛枝丰度（A%）之间存在显著差异。野生北苍术根系菌根侵染强度和丛枝丰度显著高于人工栽培北苍术，分别是栽培三年北苍术的7倍和22.6倍。

表3 栽培与野生北苍术根系菌根侵染状况Table 3 Infection of AM fungi in the root of cultivated and wild A. chinensis

2.3 北苍术根区土壤AM真菌群落OTU序列统计分析

由表4可知，各采样点北苍术土壤获得有效序列数均在10万条以上，以栽培三年北苍术（N3）根区土壤测得的有效序列数最多为73386条。各采样点土壤样品的有效序列百分比均在97%以上，平均序列长度在214～217 bp。

表4 栽培与野生北苍术根区土壤样品测序数据结果Table 4 Results of sequencing data of the soil samples from cultivated and wild A. chinensis

Shannon指数稀释曲线可以直接反映所抽取的优化测序深度合理性，并直接反映样品中物种的多样性信息。由图1可知，各供试样品的稀释曲线已趋于平滑，表明样品测序数据量足够大，测得的数据合理，可以充分反映采集土壤中绝大多数AM真菌群落的真实情况。采样点土样的Shannon指数野生北苍术大于栽培，各供试样点AM真菌群落多样性由高到低依次为样品 N4、N3、N2、N1。

图1 栽培与野生北苍术根区土壤OTU水平下AM真菌群落Shannon指数稀释曲线Fig. 1 Shannon index of AM fungi community in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis on OTU level

2.4 北苍术根区土壤中AM真菌群落多样性

由表5可知，各个供试样点土壤中AM真菌群落覆盖率均为1，说明本次检测结果能代表样本中AM真菌的多样性。多样性指标包括Shannon指数、丰度指数Sobs、均匀度指数Simpsoneven，能够反映样品中物种的丰度。野生北苍术根区土壤 AM真菌多样性（Shannon）显著高于栽培北苍术；丰度指数（Sobs）野生北苍术与栽培二、三年北苍术之间差异不显著，且随着栽培年限的增加，Sobs指数随之增加；各供试样点均匀度指数（Simpsoneven）无显著差异。

表5 栽培与野生北苍术根区土壤AM真菌群落多样性指数Table 5 Diversity of AM fungi community in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis

2.5 北苍术根区土壤AM真菌群落维恩（Venn）图分析

Venn图可以直观地体现野生和栽培北苍术根区土壤中AM真菌群落OTU组成的差异及共有物种的情况。在N1、N2、N3、N4样品中，分别有62、122、110 和 500条OTU，而且每种样品中都有其独有的OTU。栽培一年的北苍术根区土壤中特异性AM真菌群落OTU占总OTU序列数的2.4%（15）、二年生特异性AM真菌群落OTU占2.7%，三年生特异性AM真菌群落OTU占5.7%，野生北苍术中特异性AM真菌群落OTU占69.9%。栽培一年与野生北苍术根区土壤中AM真菌群落共有的OTU数量为11（2.0%），二年生与野生北苍术共有的OTU数量为44（7.6%），三年生与野生北苍术共有的OTU数量为33（5.7%），N1、N2、N3和N4共有的为2（0.32%），说明不同样品中含有相同物种的比率较小（图2）。

图2 北苍术根区土壤AM真菌群落OTU维恩图Fig. 2 Venns of AM fungi community in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis on OTU level

2.6 北苍术根区土壤AM真菌群落结构组成

群落结构组成结果表明，样本中检测到的 OTU分属于球囊菌门 Glomeromycota球囊菌纲Glomeromycete的5目6科8属。在科、属分类水平上AM真菌群落组成及相对丰度如图3所示，其中野生北苍术（N4）根区土壤中AM真菌物种球囊霉科Glomeraceae球囊霉属Glomusspp.（77.20%）为优势菌群；栽培北苍术根围土壤中AM真菌物种巨孢囊霉科Gigasporaceae巨孢囊霉属Gigasporaspp.（34.48%～47.20%）、球囊霉科球囊霉属（30.05%～53.70%）为优势菌群。可见野生北苍术根区土壤中AM真菌群落组成与栽培北苍术根围土壤有明显差异。

图3 北苍术根区土壤中AM真菌科（A）和属（B）分类水平上群落组成相对丰度Fig. 3 Percent of AM fungi community abundance in root-zone soil from cultivated and wild A. chinensis on family (A) and genus (B) level

2.7 土壤养分与AM真菌多样性相关分析

典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA）土壤养分pH、有机质（C）、碱解氮（N）、有效钾（K）、有效磷（P）与AM真菌之间的相关性可知，土壤养分因子中有机质和有效磷对承德北苍术根围土壤中AM真菌群落多样性影响较大。有机质、有效磷、pH、有效钾与AM真菌多样性指数（Shannon）和均匀度指数（Simpsoneven）呈正相关，而碱解氮与之呈负相关；有机质、pH和有效钾与丰度指数（Sobs）呈正相关，而有效磷和碱解氮呈负相关。

通过CCA分析土壤微量元素与 AM真菌群落多样性间的相关性可知，微量元素锰、硼对北苍术AM真菌群落多样性影响较大，且微量元素硼与AM真菌多样性指数（Shannon）、均匀度指数（Simpsoneven）和丰度指数（Sobs）均呈正相关，而铁、铜、锰、锌与之呈负相关。另外，由图4可知，横坐标轴从左至右表示微生物群落的Shannon指数和Sobs 指数逐渐增加，表明野生北苍术的AM真菌群落多样性、丰度均大于栽培北苍术（样品N4＞N3＞N2＞N1）。

图4 土壤大量元素（A）、微量元素（B）与AM真菌多样性指数的相关性分析Fig. 4 Correlation analysis between the diversity index of AM fungi and soil macroelements (A) and trace elements (B) on OTU level

3 讨论

3.1 野生与栽培北苍术AM真菌菌根侵染差异

陆地上绝大多数植物都能与AM真菌形成菌根共生体，药用植物就是其中一大类[22]。菌根侵染率尤其侵染强度的高低在一定程度上决定着其功能强弱[23]，进而影响植物对AM真菌的依赖性。吴志刚等首次报道了苍术对AM真菌的依赖性能达到245%[24]，并且接种AM真菌G. mosseae显著促进了苍术的营养生长，提高了苍术产量。本研究结果表明，北苍术道地产区河北承德栽培与野生北苍术根系均有AM真菌侵染，但野生北苍术菌根侵染强度和丛枝丰度显著高于栽培北苍术。野生药材是人们一直青睐的药品，而且价格远远高于栽培药材。现已有大量的研究证明，接种AM真菌可以有效提高药用植物活性成分含量[25,26]，提高其药效。因此，本研究中野生北苍术的高侵染强度能说明在北苍术药材原生境中AM真菌对药材药效的形成起着很重要的作用。

3.2 野生与栽培北苍术根区土壤中AM真菌群落组成

本研究采用高通量测序技术，检测并分析河北承德北苍术根区土壤AM真菌群落多样性和丰度。结果显示，野生北苍术根区土壤中 AM真菌群落多样性最大，其独有的 AM真菌物种种类也随之丰富，在属水平上 AM 真菌群落结构逐渐呈现单一化，其中球囊霉属的丰度最大（77.20%），为优势种属；栽培北苍术随着生长年限的增加，球囊霉属在AM真菌群落中的丰度也逐渐增大，说明AM真菌球囊霉属与该北苍术产区具有极强的亲和性，是栽培产区自然选择的土著优势菌群。AM真菌多孢囊霉属和无梗囊霉属仅出现在栽培一年北苍术和栽培二年北苍术根区土壤中，栽培三年和野生北苍术的根区土壤中则没有该属，表明随着栽培年限的延长，盾巨孢囊霉属、多孢囊霉属和无梗囊霉属慢慢淘汰至消失在该类生境中，AM真菌球囊霉属成为优势种属。表明AM真菌对环境的适应以及植物对AM真菌的适应都具有一定选择性，因此筛选道地产区野生北苍术生长环境中土著专性优势AM真菌对于人工栽培北苍术具有重要意义。

3.3 土壤养分因子与北苍术根区土壤中AM真菌物种多样性的关系

道地产区药材是指在特定的自然环境和药材品种长时间互作下产生的优质中药材，本研究中北苍术为河北承德道地药材。研究发现，土壤中矿质元素组成、含量、存在形态不仅会引起道地药材形态和品质改变，还会影响中药材的产量[27]。AM真菌存在于植物根系及土壤中，其生存环境与土壤密切相关，土壤理化性质等非生物因素对AM真菌群落结构组成具有重要影响[28]。已有研究表明土壤有机质、磷、钾等含量都会对AM真菌的群落多样性、结构组成和功能产生直接影响[29]，同样AM真菌的多样性和丰度也受到宿主植物的直接影响[30,31]。

本研究中野生北苍术根区AM真菌的多样性指数、丰度指数、均匀度指数均高于人工栽培北苍术，而且土壤pH、有机质、有效钾与AM真菌多样性和均匀度指数呈正相关，而碱解氮与之呈负相关；其中土壤有机质对AM真菌多样性和丰度影响最大，是主要影响因子。已有研究表明，土壤有机质在矿化和腐殖化过程中，释放出的能量可以提高AM真菌对植物的侵染能力，有机质含量的增加可以促进AM真菌分枝[32]，提高AM真菌的生物活性，但这种促进作用是有一定范围限制的[33]，即在一定的含量区间内，土壤中有机质含量越丰富，AM真菌的多样性越丰富。本研究中野生北苍术根区土壤中有机质含量显著高于栽培北苍术，因此野生北苍术根区土壤群落AM真菌的多样性更丰富，同时AM真菌侵染状况显著优于栽培北苍术根系。

土壤中微量元素不仅影响道地药材根系营养及生理代谢活动，还影响道地药材次生代谢产物的合成和积累，一些道地药材只有生长在富含某些特征微量元素的土壤中，其质量和疗效才能达到道地药材的标准[34]，本研究中野生北苍术根区土壤硼含量显著高于栽培北苍术，且微量元素硼与AM真菌多样性指数、均匀度指数、丰富度指数均呈正相关，而铁、铜、锰、锌与之呈负相关，说明微量元素硼可能是河北承德道地药材北苍术促进AM真菌群落建立的关键微量元素。

综上所述，本研究发现野生与栽培北苍术菌根侵染强度存在显著差异，而且野生根区土壤中AM真菌物种较栽培更为丰富，且球囊霉属是野生北苍术根区土壤中优势菌群。野生和栽培北苍术根区土壤养分的差异可能是导致AM真菌群落多样性差异的原因之一，而且土壤有机质含量是导致该差异的主要因子，硼是促进道地产区AM真菌群落多样性和丰度的微量元素。这对于筛选北苍术优势土著AM真菌，深入研究土壤因子- AM真菌-中药材品质间的关系，探索AM真菌在北苍术仿野生人工栽培的应用，提高其道地功效，提供了重要的科学依据。