白菜黑腐病拮抗菌Lysobacter enzymogenesCX03的分离鉴定及生防效果研究

张子玉，谢学文，石延霞，柴阿丽，李 磊*，李宝聚*

(1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2. 天津农学院，天津 300384)

白菜细菌性黑腐病是由野油菜黄单胞野油菜致病变种（Xanthomonas campestrispv.campestris）侵染引起的一种危害严重的细菌性病害[1]。具有寄主范围广、发病率高、防治难等特点[2,3]。目前，对该病害的防治主要依赖于化学药剂，然而施用化学农药对环境、生物体以及人类生活造成诸多负面影响。因此，利用有益微生物来防治白菜细菌性黑腐病具有广阔的应用前景。

溶杆菌Lysobacter广泛分布于自然环境中，且对多种病原真菌、细菌、线虫具有溶菌活性等典型特征[4]。目前，已发现产酶溶杆菌L. enzymogenes、辣椒溶杆菌L. capsici、抗生素溶杆菌L. antibioticus对黄瓜猝倒病、羊茅草叶斑病、小麦赤霉病、大豆锈病和水稻白叶枯病等病害具有一定的防治效果[5-7]。产酶溶杆菌作为溶杆菌属的模式种之一，国内最早报道的生防溶杆菌菌株就是产酶溶杆菌 OH11，该菌株能有效拮抗水稻纹枯病菌、辣椒疫霉、瓜果腐霉病菌等多种植物病原真菌的生长[8]，其主要作用物质为次级代谢产物热稳定抗真菌因子（Heat-Stable Antifungal Factor，HSAF）。从黄瓜根际分离得到的产酶溶杆菌3.1T8能显著拮抗黄瓜黄褐斑病菌和大豆疫霉的生长[9]。产酶溶杆菌C3能够有效防治由立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的高羊毛草褐斑病和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum引起的小麦赤霉病等，该菌对多种线虫也具有很强的拮抗活性[10,11]。产酶溶杆菌N4-7可以有效防治夏季常发的草坪斑枯病[12]。辣椒溶杆菌NF87-2可以有效控制温室中由立枯丝核菌R. solani引起的辣椒立枯病，其能够抑制真菌菌丝体的生长[13]。辣椒溶杆菌X2-3对小麦纹枯病、卵菌有较强的拮抗活性[14]。吴亚鹏和姬广海等[6]发现抗生素溶杆菌 13-1对魔芋软腐病有较好的控制效果，防效可达79.16%，能在魔芋根际高效定殖。从水稻根际分离的抗生素溶杆菌OH13对多种植物病原细菌展现较强的拮抗活性，可合成吩嗪类化合物等物质来抑制植物病原细菌[15]。然而，关于产酶溶杆菌防治植物细菌病害的研究还未见报道。

本研究从白菜根际土壤中分离得到对白菜细菌性黑腐病有拮抗作用的生防细菌，筛选出拮抗菌株CX03。通过形态特征、生理生化测定、Biolog测定、酶活特性测定和多基因系统发育树，确定其分类地位。室内盆栽试验表明，菌株CX03对白菜黑腐病具有明显的防治效果，防效可达90.4%，同时，菌株CX03还对其他4种植物病原细菌、4种植物病原真菌具有显著的拮抗作用。本研究为白菜细菌性黑腐病的生物防治提供了理论支持，同时为该菌株的进一步开发和应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 野油菜黄单胞野油菜致病变种X. campestrispv.campestris、密执安棒杆菌环腐致病变种Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus、丁香假单胞菌流泪致病变种Pseudomonas syringaepv.lachryrnans、密执安棒杆菌密执安致病变种C. michiganensissubsp.michiganensis、葡萄土壤杆菌Agrobacterium vitis、尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、立枯丝核菌Rhizoctonia solani和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea均具有较强的致病力，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分离并保存。

1.1.2 供试试剂 细菌基因组 DNA提取试剂盒（DP302，购自北京天根生化科技有限公司），无水乙醇（分析纯）纯度≥99%，2×TaqMaster PCR Mix，ddH2O，琼脂糖，TAE缓冲液，BM5000 DNA Marker。以上试剂均购于北京博迈德基因技术有限公司。

1.1.3 供试培养基 LB培养基、NB培养基、WA培养基、PDA培养基用于细菌抑菌谱的测定[16-20]，几丁质酶培养基用于几丁质酶测定[21]；CMC培养基用于纤维素酶的测定[18]，蛋白酶培养基用于蛋白酶测定[19]，生理生化特性测定所用培养基参见《常见细菌系统鉴定手册》[22]。

1.1.4 供试白菜品种 白菜“中白50”购于中蔬种业科技北京有限公司。

1.2 拮抗菌株的分离及保存

山东省寿光市露地白菜根际土壤样品，称取每份土样10 g，加入到90 mL灭菌水中，置于28 ℃恒温摇床振荡培养30 min。将混匀的土样按照10-8～10-1进行梯度稀释，选用稀释至梯度10-6、10-7、10-8的土样进行涂板，每个梯度吸取100 μL，涂布于LB培养基平板上，各涂3个平板，置于28 ℃培养2 d。挑取不同类型的菌落于LB培养基平板上进行纯化，纯化3次后，保存于-80 ℃冻存管中。

1.3 拮抗菌株的筛选

1.3.1 供试菌株的培养 将-20 ℃保存的野油菜黄单胞野油菜致病变种菌株采用NA培养基平板上活化，28 ℃培养2 d，进行生防菌筛选。

1.3.2 拮抗菌筛选 采用Stonie双层培养法[20]，将拮抗菌株接种在液体LB培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养16 h，调节菌悬液浓度至108cfu/mL。在90 mm PDA平板中心接种5 μL拮抗菌株的菌悬液，以接种液体LB培养基为空白对照，28 ℃下培养24 h后在通风橱中向倒扣的培养皿中加入3 mL氯仿，静置12 h。将野油菜黄单胞野油菜致病变种接种于NB培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养36 h，调节菌悬液浓度至108cfu/mL。在4 mL 5%（m/v）WA培养基中加入100 μL病原菌菌悬液，混匀后倒入PDA平板，作为上层。28 ℃培养48 h观察并测量抑菌直径。计算抑菌率，每个处理重复3次。抑菌率（%）＝抑菌直径/对照菌落直径×100。

1.4 拮抗菌株CX03的鉴定

1.4.1 菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定 将菌株CX03在NA培养基上进行划线，置于28 ℃培养1～2 d，观察其菌落颜色和形态，同时参考《常见细菌系统鉴定手册》[22]的方法，对菌株CX03进行革兰氏染色、生长温度试验、耐盐性试验、滑移运动试验、接触酶试验、V-P 试验、柠檬酸盐的利用试验、淀粉水解试验、明胶液化试验等生理生化试验。

1.4.2 Biolog检测 挑取菌株CX03单菌落接种至 NA 培养基试管斜面上，28 ℃培养24 h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用 BIOLOG GENⅢ试剂盒（按照试剂盒说明书操作）对菌株CX03进行唯一碳源利用的测定。

1.4.3 菌株CX03多基因系统发育树构建 采用细菌DNA提取试剂盒提取菌株CX03的基因组DNA后，利用细菌16S rDNA的通用引物和看家基因atpD、gyrB、rpoD的扩增引物（表1），对菌株CX03的16S rDNA、atpD、gyrB、rpoD基因进行PCR扩增。PCR运行程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共34个循环；72 ℃延伸10 min。所得产物由博迈德生物公司进行序列测定。其余序列均下载于NCBI网站，用MEGA7.0、Sequence Matrix、Seaview4按顺序连接、比对不同菌株的16S rDNA和atpD、gyrB、rpoD基因序列，采用最大似然法构建系统发育树，分析其分类地位。

表1 用于扩增4个看家基因的引物Table 1 Primers for amplifying four housekeeping genes

1.5 菌株CX03抑菌谱测定

采用双层培养法对野油菜黄单胞野油菜致病变种X. campestrispv.campestris；密执安棒杆菌环腐致病变种C. michiganensissubsp.sepedonicus；葡萄土壤杆菌A. vitis；密执安棒杆菌番茄溃疡病致病型C.michiganensissubsp.michiganensis；丁香假单胞菌流泪致病变种P. syringaepv.lachryrnans5种病原细菌进行抑菌测定，具体操作步骤同1.3.2。

采用平板对峙法[24]对尖孢镰刀菌F. oxysporum；疫霉菌P. capsici；立枯丝核菌R. solani；灰葡萄孢B. cinerea进行抑菌谱测定。在PDA平板中央接种直径5 mm所选取的真菌靶标菌片，28 ℃下培养2 d；在距平板中央3.5 cm处接种5 mL菌株CX03浓度为108cfu/mL菌悬液。以液体LB培养基为空白对照，28 ℃培养5 d。每个处理重复3次。测量靶标菌的对照菌落直径和处理菌落直径，用抑菌率表示。抑菌率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.6 菌株CX03生长速率及pH值测定

将菌株CX03接种在液体NB培养基中，28 ℃下振荡培养16 h后，将菌悬液加入NB培养基中，调节OD600为0.8，共设置3个重复，放置28 ℃摇床培养。每隔4 h测1次，连续测量48 h，记录每次测得菌落数及pH值，绘制生长曲线。

1.7 菌株CX03酶活特性检测

1.7.1 蛋白酶检测 在蛋白酶培养基中心位置接种5 μL OD600为0.8的菌株CX03的菌悬液，每个处理重复3次，28 ℃培养24 h后观察消解圈。

1.7.2 纤维素酶检测 在CMC培养基中心位置接种5 μL OD600为0.8的菌株CX03的菌悬液，28 ℃培养24 h后，3 mL刚果红染料染色30 min，5 mL 1 mol/L NaCl溶液脱色15 min，每个处理重复3次，观察消解圈。

1.7.3 几丁质酶测定 在几丁质酶培养基中心位置接种5 μL OD600为0.8的菌株CX03的菌悬液，每个处理重复3次，28 ℃培养3 d后，观察消解圈。

1.8 菌株CX03盆栽防效试验

采用喷雾接种法[25]进行防效测定，将黑腐病原菌接种在液体LB培养基中，28 ℃下振荡培养 24 h，调整菌悬液1×108cfu/mL，选取大小基本一致的白菜幼苗，均匀喷施黑腐病原菌菌悬液，处理24 h后，均匀喷施生防细菌菌悬液，共设置3个处理：（1）菌株CX03菌悬液100倍液（1×108cfu/mL）；（2）3%春雷霉素1000倍液；（3）清水对照。每个处理8株苗，其后每天观察白菜发病情况。计算发病率、病情指数与防治效果。白菜细菌性黑腐病病情分级标准[26]为：0级，无病；1级，每叶有病斑1～5个；3级，每叶有病斑6～10个；5级，每叶有病斑 11～15个；7级，每叶有病斑 16～20 个；9级，每叶有病斑 21个以上。发病率（%）＝100×发病总叶数/调查总叶数，病情指数＝100×∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×9），防治效果（%）＝100×（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数。

1.9 数据统计与分析

利用GraphPad Prism 8软件绘图，采用 IBM SPSS Statistics 20 对试验数据进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 白菜细菌性黑腐病拮抗细菌的分离与抑菌效果

从白菜根际土壤中分离得到 8株细菌，采用 Stonie双层培养法筛选以野油菜黄单胞野油菜致病变种X. campestrispv.campestris为指示菌有拮抗作用的生防菌，其中4株生防菌抑制率在20%以上。菌株CX03的抑菌效果最好（图1），抑菌直径达3.10 cm，抑菌率达到34.40%（表2）。因此，选取菌株CX03作为野油菜黄单胞野油菜致病变种拮抗菌。

图1 菌株CX03对白菜黑腐病的抑制效果Fig. 1 The inhibitory effect of strain CX03 on black rot of Chinese cabbage

表 2 8株生防细菌对白菜黑腐病的抑制效果Table 2 Inhibition effect of eight strains of biocontrol bacteria on black rot of Chinese cabbage

2.2 白菜细菌性黑腐病拮抗菌株CX03的鉴定

2.2.1 菌株CX03生理生化指标测定 菌株CX03在NA培养基，菌落形态都呈淡黄色，菌落表面突出，菌体湿润有光泽，粘液状，不易挑起。同时结合菌株CX03生理生化测定，菌株CX03为革兰氏阴性菌，28 ℃～37 ℃，NaCl含量1%可以生长，具有滑移性。接触酶、柠檬酸盐利用、明胶液化反应为阳性，淀粉水解、V-P反应为阴性。Biolog检测结果表明，菌株CX03可以利用D-麦芽糖、D-海藻糖、D-松二糖和α-D-乳糖，不能利用葡聚糖、水苏糖、龙胆二糖和D-蜜三糖（表3）。通过透射电镜观察可以看到菌株CX03菌体均无鞭毛，菌体为杆状（图2）；通过扫描电镜观察到菌株表面有褶皱。初步鉴定菌株CX03为溶杆菌属细菌。

图2 菌株CX03的形态观察Fig. 2 Morphological phenotype of strain CX03

图 3 菌株CX03基于多基因序列的系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of based on the multigene sequences of strain CX03

表3 菌株CX03生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characters of strain CX03

2.2.2 16S rDNA基因扩增及序列分析 基于PCR扩增获得菌株CX03的16S rDNA和3个管家基因gyrB、atpD、rpoD序列，用MAGA7.0软件，采用最大似然法构建菌株CX03多基因系统发育树，分析显示菌株CX03与产酶溶杆菌标准菌株L. enzymogenesATCC 29487T聚在一簇，同源性达到100%（图3）。与已报道的产酶溶杆菌L. enzymogenesOH11的同源性达到97%。综上所述，通过确定菌株CX03的培养形态、生理生化特性及多基因系统发育分析，鉴定菌株CX03为产酶溶杆菌。

2.3 菌株CX03抑菌谱测定

菌株CX03对5种病原细菌均具有较好的抑菌效果，其中对黄单胞菌抑菌率最高达到35.40%，显著高于其他4株病原菌；对4种病原真菌也具有一定抑菌效果，对灰葡萄孢菌抑菌率可达24.92%，说明菌株CX03具有广谱拮抗作用（表4、图4）。

图4 菌株CX03对5种病原菌的抑制作用Fig. 4 Inhibition effect of strain CX03 on 5 kinds of pathogenic bacteria

表4 菌株CX03对九种病原菌的抑制效果Table 4 The inhibitory effect of CX03 on 9 different pathogenic bacteria

2.4 菌株CX03生长特性及酶活特性检测

生长特性测定结果表明，菌株CX03在0～20 h时处于指数增长期，20 h时菌落数达到2.01×1011cfu/mL，34 h后达到对数生长期，进入稳定增长期。pH值随着时间逐渐增加，在48 h时pH值达到8.15（图5）。

图5 菌株CX03生长曲线及pH值测定Fig. 5 Bacterial biomass and pH during the growth of strain CX03

酶活特性检测结果表明，菌株CX03在CMC培养基上经过染色、脱色，形成黄色透明圈，在蛋白酶培养基、几丁质酶培养基中都有非常明显的的透明圈产生。因此，推测菌株CX03代谢产物中包含纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶（图6）。

图6 菌株CX03酶活性测定Fig. 6 Enzyme activity of strain CX03

2.5 菌株CX03防治白菜细菌性黑腐病防效测定

在温室条件下，检测菌株CX03对白菜细菌性黑腐病的防治效果结果表明，菌株CX03处理组的病情指数为8.40，显著低于春雷霉素处理组的病情指数14.40，及对照试验组的病情指数90.60。菌株CX03对白菜黑腐病的防效达90.70%，也显著高于春雷霉素的防效84.10%（表5，图7）。

表5 菌株CX03对白菜黑腐病的盆栽防效Table 5 Control efficiency of strain CX03 on black rot of Chinese cabbage

图7 菌株CX03对白菜黑腐病盆栽防效Fig. 7 Control efficiency of strain CX03 on black rot of Chinese cabbage

3 讨论

本试验从山东省寿光市露地白菜根际土壤分离获得一株对白菜细菌性黑腐病具有良好拮抗作用的生防细菌CX03。根据扫描电镜观察到菌株CX03呈杆状、菌体无鞭毛；生理生化特性中革兰氏染色阴性，V-P反应阴性，具有滑移运动能力；通过多基因系统发育树分析，菌株与产酶溶杆菌标准菌株ATCC 29487T以及其他已报道的产酶溶杆菌菌株（OH11、C3、M497-1、YC36等）聚在一簇，在形态特征上及生理生化特性上符合产酶溶杆菌的描述[27]。综合多种鉴定结果，菌株CX03鉴定为产酶溶杆菌L. enzymogenes。

溶杆菌属细菌对多种病原微生物包括真菌、细菌、卵菌和线虫等都具有较高的拮抗活性[28]，目前在生防报道中产酶溶杆菌研究报道较多，产酶溶杆菌OH11是以产生次生代谢产物热稳定抗真菌因子HSAF对真菌及卵菌产生拮抗作用，HSAF通过调节神经酰胺酶的合成途径来改变菌丝的形态，从而达到控制病害的目的[29]。辣椒溶杆菌AZ78产生2,5-二酮哌嗪对马铃薯晚疫病菌和霜霉病菌具有较高的拮抗活性[7]。抗生素溶杆菌OH13产生一种具有广谱抗细菌活性的物质myxin[30]。Wei等[31]通过采用高效液相色谱、质谱等技术从抗生素溶杆菌13-1发酵液中成功分离出6-甲氧基-10氧基-1-吩嗪醇、吩嗪、吩嗪-1-羧酸及1-羟基-6-甲氧基吩嗪四种吩嗪类化合物，对水稻白叶枯病原菌有强烈的抑菌活性。Harad等[32]从溶杆菌 8294发酵液中分离得到对革兰氏阳性细菌有拮抗抑菌作用的次生代谢产物WAP-8294A2。Hashizume等[33]从溶杆菌属细菌发酵液中分离出缩氨酸类抗生素tripropeptins A、B、C、D和Z，对革兰氏阳性细菌有较强的抑菌作用。本研究中，产酶溶杆菌CX03对5种病原细菌和4种病原真菌均具有明显的抑制效果。基于菌株CX03全基因组序列信息和antiSMASH分析，预测菌株CX03可合成菌黄素（xanthomonadin I）、溶杆菌素（lysobactin）、吩嗪类物质（Le-pyrrolopyrazines）等11种次生代谢产物，但菌株CX03次生代谢物中不含有热稳定抗真菌因子（HSAF）。此外，菌株CX03还包含特有的次生代谢物thailanstatin A、lankacidin C（数据未发表），推测其抑制植物病原细菌活性可能与其特有的次级代谢产物有关，但具体是哪类物质、或者其中一种或几种物质协同作用，还需进一步探究。酶活特性测定表明，菌株CX03可以分泌纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶，推测其抑菌作用与其分泌的胞外水解酶也相关。

本研究报道了一株产酶溶杆菌CX03对白菜黑腐病菌有显著抑菌活性，该菌可以分泌多种胞外水解酶并预测可合成多种次生代谢产物，具有较广的抑菌谱。温室盆栽试验证明，菌株CX03对白菜黑腐病的防治效果达90.7%。这些结果说明菌株CX03在植物病害生物防治研究中具有一定的开发潜力。下一步研究将围绕菌株CX03抑菌机理和发酵工艺进行深入研究，为后续揭示该菌株的生防机制和生防产品研发及应用提供理论和试验依据。