广西崇左发现一种草地贪夜蛾幼虫寄生性天敌——日本追寄蝇

高祖鹏，唐照磊，郭井菲，何康来，王振营*

（1. 中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2. 吉林农业大学生物防治研究所，长春 130118；3. 广西农业科学院玉米研究所，南宁 530007）

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)隶属于鳞翅目夜蛾科，又被称为“秋黏虫”，是原生于美洲热带和亚热带地区的一种多食性、迁飞性重大农业害虫[1]。该虫取食范围广，不仅可取食玉米，还可以取食小麦、棉花、甘蔗等80余种植物[2,3]。自2019年1月首次入侵云南，随着季风逐渐由南向北迁飞，截止至2019年9月，已蔓延至全国26个省份，对我国玉米等农作物安全生产构成了严重威胁[4]。

草地贪夜蛾的防治方法主要有农业防治、生物防治、理化诱控、化学防治和监测技术[5]。化学防治具有见效快的特点，是防止草地贪夜蛾扩散的主要方法，但任何化学农药的施用，都会导致害虫产生抗药性[6]。根据国外的报道，草地贪夜蛾已经对拟除虫酯类、双酰胺类、新烟碱类等多种杀虫剂产生了较高的抗药性[7,8]。生物防治作为IPM的重要组成部分，通过自然天敌资源的保护利用或人工扩繁释放，以经济、环保的方式将害虫控制在经济损失允许水平之内[9]。草地贪夜蛾作为新入侵我国的重大农业害虫，开展本土天敌昆虫资源的调查，对于合理保护利用和人工扩繁释放，有效地利用当地天敌资源控制草地贪夜蛾的为害具有重要意义，且可达到绿色可持续性防控。

开展天敌昆虫资源的调查，首先要进行种类的鉴定。除了传统的形态学鉴定外，随着分子技术和生物信息学的发展，Hebert等[10]于2003年首次提出了利用线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（Mitochondrial cytochrome coxidase subunit Ⅰ，COI）基因中特定的一段序列对生物物种进行分子鉴定。近年来该技术被广泛应用于大多数动植物类群的系统分类学研究，并且其有效性得到了很好的验证[11,12]。基于DNA条码技术，汤印等[13]对草地贪夜蛾幼虫寄生蜂进行鉴定，明确了3种草地贪夜蛾幼虫寄生蜂分别为斯氏侧沟茧蜂Microplitis similis、半闭弯尾姬蜂Diadegma semiclausum(Hellen)和斜纹夜蛾长距姬小蜂Euplectrus laphygmae(Ferrière)；李志刚等[14]通过采集于粤港地区被寄生的草地贪夜蛾卵块，鉴定出两种草地贪夜蛾卵寄生蜂夜蛾黑卵蜂Telenomus remus(Nixon)和螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis(Ishii)。因此，DNA条形码技术对草地贪夜蛾天敌的发现与应用提供了技术支持。

本研究通过对采自田间的草地贪夜蛾幼虫进行室内饲养，而后统计寄生该幼虫的天敌数量，并结合形态鉴定来明确寄生草地贪夜蛾的寄蝇种类。同时，运用DNA条码技术对其进行二次鉴定，为开展草地贪夜蛾天敌的保护利用提供重要基础。

1 材料与方法

1.1 形态鉴定

草地贪夜蛾大龄幼虫（5～6龄）于2020年6月4日采自广西崇左市扶绥县广西大学农学院扶绥基地玉米田（22°51′80′ N，107°78′16′ E），单头放置在 5 mL 的离心管中饲养，待寄生蝇蛹的出现后，将其收集并单头放入新的5 mL离心管中，置于温度（26±1）℃，相对湿度65%±5%，光周期14L:10D的人工气候箱（上海一恒科学仪器有限公司，MGC-450HP-2）内。每日观察寄生蝇的羽化情况。待成虫羽化后，将成虫置于冰块上，待其静止后，在超景深三维显微系统（vhx-2000，KEYENCE，日本）下拍照，观察其形态特征。采用传统昆虫分类的形态鉴定方法确认其为日本追寄蝇Exorista japonica(Townsend)，并描述该成虫的形态特征。

1.2 分子鉴定

取2头寄生蝇用液氮研磨成粉末，放入1.5 mL离心管中，采用DNA小量抽提试剂盒（天漠生物，TD620-50）提取其DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计对DNA完整性和纯度进行检测，之后对COⅠ基因扩增，上游引物为 LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′），下游 HCO2198（5′-TAA ACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[16], 委托上海生物工程技术服务有限公司合成引物。PCR扩增反应体系包括：DNA 模板 1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL、Taq PCR Master Mix（2×blue dye）、dd H2O补足至20 μL。扩增条件：第一步94 ℃预变性4 min；第二步94 ℃变性45 s，52 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；第三步72 ℃延伸7 min；第四步4 ℃保温。取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（生工B518141）将目的条带切胶回收，由上海生工生物工程公司进行双向测序和拼接，将所得结果与NCBI数据库进行BLAST比对，根据序列一致性确定对应物种种名或属名。

2 结果与分析

2.1 形态特征

本次田间采样共采集到草地贪夜蛾幼虫171头，除去死亡的3头外，存活下的幼虫中被寄蝇寄生的为20头，寄生率为 11.90%。同时还观察了日本追寄蝇产卵寄生草地贪夜蛾的情况。雌寄蝇将卵产在草地贪夜蛾幼虫腹部节间膜附近，卵呈乳白色或浅绿色，长约200 μm（图1）。

图1 产于草地贪夜蛾幼虫体表的寄蝇卵粒（红圈内）Fig. 1 E. japonica egg oviposited on the surface of S. frugiperda lavae (in red circle)

寄蝇体长6～13 mm。后小盾片呈垫状突起，下侧片披一行鬃状毛（图2A）。前胸腹片两侧缘披毛。头部具向后弯曲的内侧额鬃2根，后足胫节末端无腹端刺（图2E）。翅前鬃显著小于盾沟后方的第一根背中鬃。翅的中脉曲角为直角，后方具褶痕，胸部翅上鬃之间具填充小鬃（图2F）。后头上半部在眼后髯后方，无小黑毛，髯上方的颜堤髯仅分布在颜堤下方，至多不超过颜堤长度的1/2，髯位于口缘上方，水平，口缘向前突出。

复眼裸，额宽为复眼宽的2/3，间额两侧缘平行，较侧额窄；侧额宽为触角第三节的1.5～2倍。触角黑色，第三节长为第二节的2.5～3倍（图2G）。雄虫侧额、侧颜覆金黄色粉被，雌虫则覆灰黄色粉被，触角第三节长为第二节的2倍。侧颜披稀疏短黑毛，颊披细长的黑毛；单眼鬃着生于前后单眼之向头部背中线交叉排列，下额须呈黄色。胸部黑色，覆灰黄色粉被，背面有5条黑纵纹，中间1条较细。小盾片基半部黑褐色，端半部暗黄色。

翅灰色透明，前缘刺粗长，与径中横脉的长度相等，中脉曲角至翅后缘的距离远大于由中脉曲角至中肘横脉之间的距离（图2F）。覆白色粉被，各背板上的粉被沿背线中断，形成1条黑色纵条。无中心鬃。雄虫的肛尾叶细长，末端呈梭镖形[15]（图2H）。

图2 日本追寄蝇雄虫形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of E. japonica

2.2 分子鉴定结果

利用COI通用引物对提取的DNA样品进行PCR扩增，其结果如图3所示，扩增片段大小约663 bp，在GenBank数据库进行同源性对比，待测寄蝇与日本追寄蝇E. japonica（GenBank登录号：NC_044409.1）的CO I 基因核苷酸序列一致性为99%，初步鉴定其为日本追寄蝇。

图3 待鉴蝇种COI基因片段PCR扩增结果Fig. 3 PCR profiles of COI genes form unknown tachinid fly species

分别根据CO I基因，利用软件Mega 5.2的邻接法构建系统发育树，可以确定待测寄蝇为日本追寄蝇（图4）。

图4 邻接法构建的日本追寄蝇与其他寄蝇和黑腹果蝇基于COI基因构建的系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of COI of E. japonica, other tachinid flies and D. melanogaster by neighbor-joining method

3 讨论

草地贪夜蛾自2019年1月入侵我国以来，研究人员对其防控技术开展了大量的研究，化学防控为目前的主要防控策略。由于草地贪夜蛾易对化学药剂产生抗性，同时还会杀伤天敌昆虫和非靶标生物以及农药残留等，因此草地贪夜蛾的长期防控策略应侧重绿色防控、生态调控等措施[18]。“以虫治虫”是生物防治的主要方法之一，草地贪夜蛾天敌种类丰富，据不完全统计，在世界范围内，草地贪夜蛾的天敌有 10科170种寄生蜂、4 科66种寄生蝇和丰富的捕食性天敌昆虫等[19,20]。

我国地域辽阔，地形复杂，生态类型多样，植被种类多且覆盖率广，因此具有丰富的天敌资源。目前国内已有诸多草地贪夜蛾寄生性天敌的报道，其中多以膜翅目寄生蜂为主，卵寄生蜂，如夜蛾黑卵蜂[14]、螟黄赤眼蜂[14]；幼虫寄生蜂，如斯氏侧沟茧蜂[13,21]、斜纹夜蛾长距姬小蜂[13]、半闭弯尾姬蜂[13]、淡足侧沟茧蜂Microplitis pallidipes(Szepligeti)[22]和蛹寄生蜂——霍氏啮小蜂Tetrastichus howardi(Ollif)[22]，以及卵幼虫寄生蜂：台湾甲腹茧蜂Chelonus formosanus(Sonan)[22]。

DNA条形码技术主要被用于鉴定近缘种或者建立数据库、分析某个大的类群。前者一般是同一个属或者同一个科，但个体小、形态鉴定困难的几个种[23-25]，常常用于一个总科甚至目或者某一个大的区域同类昆虫的区分[26,27]。本研究从田间采集的草地贪夜蛾幼虫中发现了一种寄生蝇，并利用DNA条形码技术对该寄蝇进行了序列测定和对比分析，明确了其为日本追寄蝇。结合形态特征鉴定进一步确定为日本追寄蝇，其田间自然寄生率高达11.90%。在黔南地区调查发现茧蜂科与姬蜂科对草地贪夜蛾田间寄生率分别为3.00%和20.00%[28]；在德宏田间调查发现斯氏侧沟茧蜂、半闭弯尾姬蜂与斜纹夜蛾长距姬小蜂，田间最高自然寄生率分别为12.00%、22.30%和5.33%[13]。由此可以看出日本追寄蝇对草地贪夜蛾具有较高的寄生率。本研究极大地丰富了草地贪夜蛾的天敌资源。

日本追寄蝇属于大型卵寄蝇，雌蝇将尚未完成胚胎发育的卵产于寄主体表，待幼虫孵化后，其采用口器凿开寄主表皮进入寄主体内，并游离一段时间后，选择合适部位形成寄生组织[15]。研究发现日本追寄蝇偏向于将大部分卵产在家蚕Bombyx mori幼虫靠近头部区域的前胸部，其次是头部，只有很少的卵产于腹部，且产卵位置与寄生成功率有着极密切的关系[29]。本研究发现，日本追寄蝇雌虫将卵块产于草地贪夜蛾幼虫腹部，并未观察到幼虫头部带有卵粒的情况，这是否与草地贪夜蛾高龄幼虫具有较高的攻击性有关尚需进一步研究。李扬等[29]选择家蚕、人纹污灯蛾Spilarctia subcarnea、美国白蛾Hyphantria cunea作为寄主，研究日本追寄蝇对不同龄期寄主的着卵量，结果发现日本追寄蝇偏好寄生这三种鳞翅目高龄幼虫。日本追寄蝇对草地贪夜蛾不同龄期幼虫的寄生选择偏好性，有待进一步试验观察。

日本追寄蝇与膜翅目寄生天敌相比，拥有较好的寄生率，并在国内已经有了较为完整的繁殖技术，史永善[30]提出用黏虫Mythimna seperata幼虫做为寄主饲养日本追寄蝇，因此为其田间应用提供了基础。