SARS-CoV-2的核酸检测实验室质量控制分析

王迪

【摘要】目的：核酸检测结果是临床确诊SARS-CoV-2感染的重要依据，实验室检测结果的准确性和及时性尤为重要。方法：通过国家发布的一系列诊疗依据、实验室准则、生物安全法等相关内容，结合本实验室核酸检测的经验及本人培训学习的知识体系，从整个实验室流程分析实验室检测存在的关键问题，质量控制的关键，从而降低实验室核酸检测存在的漏检、假阴性的情况。结果：多方面的因素影响SARS-CoV-2的核酸检测的质量，但是样本采集、运输、人员是注意的影响因素。结论：综合因素影响核酸检测的质量，从人员培训、样本采集、室间质控多方面加强实验室管理，降低实验室漏检、假阴性的结果。

【关键词】新冠病毒;核酸检测;质量控制;人员培训

2019新型冠状病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2，以下简称新冠病毒）属于冠状病毒科，β冠状病毒属，是一种单股正链RNA病毒。SARS-CoV-2对紫外线和热敏感，在56℃加热30分钟即可失活，对乙醚、75%乙醇、氯、过氧乙酸和氯仿等脂溶性消毒剂敏感，但氯己定不能有效灭活病毒。核酸检测作为病毒感染的直接证据在疾病的诊断、治疗和防控中起到关键作用。国家卫健委15日发布《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》，其中明确，新型冠状病毒核酸检测阳性为确诊的首要标准。

实验室工作的质量保证应覆盖整个SARA-Cov-2核酸检测流程，结果的准确性依赖于分析前、分子中和分析后阶段的质量控制，对于SARA-Cov-2核酸检测来说，分析前过程尤为重要，如果没有有效的采集到标本或运输和保存不当使得标本质量降低，后续核酸检测的质量就无从谈起。

1.分析前质量控制

1.1样本的采集

1.1.1采集标本的种类

根据《新冠病毒样本采集和检测技术指南》，每个病例必须采集急性期呼吸道标本，重症病例优先采集下呼吸道标本;根据临床需要，采集便标本、全血标本、血清标本和尿标本。物品和环境标本根据检测需求采集，不同类型标本核酸检测阳性率和病毒载量不同。临床实际中约2/3的患者表现为干咳、无痰，因此目前最常用的标本仍为鼻咽拭子。

1.1.2鼻咽拭子的采集

在选择恰当的采样时机和标本类型的同时，必须采集到含有病毒的细胞，这是正确检出RNA的前提。不恰当的标本采集是导致核酸检测假阴性的一个非常重要的因素，如果没有采集到合格的标本，即使后续过程中检测试剂合格、实验操作规范和质量管理严格，也不可能得到准确可靠的结果。

鼻咽拭子采集的部位不不准确、力度和深度不够、停留时间不够等都是影响后续检测结果准确性的重要因素。咽拭子采集需要在两侧咽扁桃体来回擦拭至少3次，由于个人敏感度不同，容易引起强烈的生理反应导致咳嗽喷嚏，产生气溶胶对采样人员产生危险，采样者心理素质不强导致采样不到位，核酸标本质量差，容易產生假阴性结果。

因此要求采样人员接受技术规范与操作规程、生物安全防护知识和实际操作技能培训，熟练掌握鼻咽拭子、口咽拭子等的规范采集方法，并且考核合格后才能进行标本的采集，后期仍需多次复训，强调规范采样。

1.2样本的保存与运输

由于SARA-Cov-2属于RNA病毒，核酸容易发生自降解和生物酶介导的降解，高温、反复冻融或标本保存不当都会造成核酸降解，影响标本质量，因此对标本的保存和运输提出了更高的要求。《新冠病毒样本采集和检测技术指南》中指出，可在24小时内检测的标本可4℃保存，24小时内无法检测的标本应-70℃或以下保存（如无-70℃保存条件，则-20℃暂存）。如需运输，标本采集后室温（25℃）放置不宜超过4小时。如需长途运输建议采用干冰等制冷方式进行保藏。标本运送期间应当避免反复冻融。

1.3实验室设备与试剂的选择

核酸提取是检测结果精密度的保证，提取使用的标本量和检测过程应按照试剂说明书进行，因为这些因素都可能对核酸的提取成功与否产生影响。在提取仪器使用过程中应严格按照要求进行设备的清洁与维护，并做好记录，确保检测结果的准确性。

市场上试剂品牌众多，试剂盒的质量和性能参数设置难免会有瑕疵，不同的试剂盒检测靶标、灵敏度、特异性与稳定性都存在差异，不能排除个别样本基因组变异等原因导致的假阴性的可能，因此在结果判定时需要谨慎，采取两种以上的不同试剂盒进行判定。

1.4 人员培训

符合核酸检测规定资质（PCR上岗证）的实验室工作人员经过生物安全培训考试合格方能上岗。定期针对新型冠状病毒开展专项培训和考核。实验人员在检测过程中，严格按照标准操作规程执行，强化生物安全意识，规范操作，注意实验过程中的操作细节，提高数据分析能力。

2.分析中质量控制

2.1 试剂准备

根据试剂配制使用说明书严格配置，从冰箱冷冻取出的试剂要常温融化，一定要混匀离心，如果试剂融化没有混匀，这时候配置的试剂状态是不均一的，会影响后期扩增，影响结果。

2.2 核酸提取与扩增

核酸提取是检测结果的精密度的保证。现核酸提取使用最多的方法为磁珠分离法，提取使用的标本量和检测的过程严格按照说明书进行。为避免造成批次间和批次内的污染，核酸提取过程中采用3个阴性对照随机放置在样本中共同参与提取，此过程用来监控可能发生的环境污染。另外实验室要采用带有滤芯的枪头，加样的顺序依次为样本、阴性对照、阳性对照，防止污染。

目前核酸扩增使用最广泛和技术成熟度最高的方法为实时荧光RT-PCR。参照试剂说明书设置核酸扩增的实验程序，多人检查保证时间、温度、循环次数等设置正确。为尽量避免光学混匀现象，PCR预混液与核酸提取物一定要混匀，上机时的反应体系不要有大的气泡，气泡形成折射，干扰荧光的采集，可以采用适当的离心机混匀去除气泡，最后在上机前，一定要检查密封是否完整，防止扩增时液体的蒸发，导致实验失败，又造成实验室核酸污染。扩增完成后反应体系不可打开，直接至于垃圾袋中封口，不可高压，按一般医疗废弃物移出实验室处理。

2.3 室间质量评价

室内质量控制和室间质量控制是检测质量保证的重要部分。每批次检测至少一份弱阳性质控品（第三方质控品）、3份阴性质控品（生理盐水）、3份环境质控品（开盖过夜生理盐水），质控品随机放在标本中，参与从提取到扩增的全过程（采集和技术指南）。弱阳性质控定为阳性，3份陰性质控品全部测定为阴性，视为在控，反之则为失控，应立即停止实验分析原因，在分析和确定失败原因后，必须使用储存或信采集的样本进行重新检测。

3分析后质量控制

3.1结果的判定

SARA-Cov-2核酸检测数据分析是获得核酸检测结果的重要环节。新型冠状病毒肺炎防控方案 （第八版）核酸检测方法主要针对新冠病毒基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。

无Ct值、无S形扩增曲线判阴性。Ct值小于等于检出限，且有S形扩增曲线，判阳性。Ct值位于灰区，建议重复实验，若重做Ct值仍处于灰区，但出现明显的S形扩增曲线，该样本判断为阳性，否则为阴性。

3.2实验室维护

防止污染是贯彻PCR实验室的准则定律。每次实验结束要采取有效措施保证样本的安全，用75%的酒精擦拭提取仪台面、操作台面、垃圾桶等，开启移动紫外灯、屋顶紫外灯、生物安全柜紫外灯照射有效时间，所有垃圾采用双层垃圾袋避免液体泄露，最后进行高压灭菌处理。

4.总结

影响SARA-Cov-2核酸检出率的因素涉及各个环节，实验室的质量保证覆盖到整个检测流程，做好每一个环节的质量把控，规范实验室操作，严格的室内质量控制，积极参加室间质评，避免实验室产生假阴性的结果。同时，采样人员应与实验室密切配合，加强对标本的采集、保存、运输等方面的质量把控，规避风险。

参考文献：

[1]国家卫生健康委和中医药局 《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版修订版）

[2]国家卫生健康委和中医药局 《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版修订版）》

[3]国家卫生健康委和中医药局 《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版修订版）》

[4]Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus inWuhan，China https：//www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736（20）30183-5/fulltext#%20）

[5]张瑞， 李金明. 如何减少新型冠状病毒核酸检测的"假阴性". 中华医学杂志， 2020， 100（00）：E008-E008.

[6][7][8]新冠病毒样本采集和检测技术指南