正己烷亚急性吸入染毒致大鼠肝肾毒性的机制

邱正义，陈辉婷，潘艺梅，洪啟铸，罗凌凤，汪靖，李昱辰

福建医科大学公共卫生学院 a.预防医学系 b.实验中心，福建 福州 350004

正己烷（n-hexane）是一种通过原油裂解而产生的有机溶剂，主要用于制造黏合鞋革、箱包的黏胶，也常应用于电子信息产业生产中的清洗作业。随着我国工业的发展，越来越多的工人与正己烷发生职业接触［1-2］，且正己烷职业中毒人群中女性比例明显高于男性［3］。在职业暴露条件下，正己烷经呼吸道吸入体内，经过肝脏等代谢，最终主要由肾脏排出体外。目前正己烷神经损伤及机制方面报道较多［4-5］，但肝肾毒性损伤及机制报道较少。肝脏是大多数毒物作用的靶器官，参与机体内毒物转化的过程［6］。正己烷主要在肝脏内代谢，主要代谢产物为2，5-己二酮、2-己醇和2-己酮等［2］，这一活化代谢过程主要由肝脏内的P450酶系完成。细胞色素P450家族1亚家族A成员2（cytochrome P450 family 1 subfamily A polypeptide 2，CYP1A2）是肝脏中重要的CYP450氧化酶之一，含量约为肝总CYP450氧化酶的13%［7］。环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）在正常生理状态下基本检测不到，但在内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）状态下其表达显著升高，是ERS的标志之一［8］。本研究通过建立正己烷吸入染毒模型，观察肝脏和肾脏组织结构和功能的改变，研究肝脏代谢酶CYP1A2基因和肾脏组织CHOP基因的表达，初步探讨正己烷是否干扰肝脏组织代谢功能，是否会诱发肾脏组织ERS反应，为进一步研究正己烷的肝肾毒性及其机制提供新思路。

1 对象与方法

1.1 试剂及器材

1.1.1 主要试剂 正己烷（上海国药集团，中国），PBS（北京中衫金桥共公司，中国），DEPC（Invitrogen公司，美国），TRIZOL REAGENT（Invitrogen公司，美国），PrimeScriptTMRT Reagent和SYBR@ Premix Ex TaqTM试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司，中国］。丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，SCr）等检测试剂盒均购自中国南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要器材 SP5型激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国），CH8606电子分析天平（Mettler Instrumente AG公司，瑞士），Z323K台式离心机（Hermle公司，德国），生物组织包埋机（浙江省金华市科迪仪器有限公司，中国），石蜡切片机（Leica公司，德国），电热恒温水浴锅（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，中国），UV755B型紫外分光光度仪（海精密仪器科学有限公司，美国），-80℃超低温冰箱（SANYO公司，日本），7500型实时荧光定量PCR仪（ABI公司，美国），CK40-F200 BH-2型倒置显微镜（Olympus公司，日本），RCO3000TVBA CO2培养箱（REVCO公司，美国），96孔培养板（Costar公司，中国），MK3型酶标仪（Thermo公司，美国），L-RDJ/1000静式染毒柜（广州市九方电子设备有限公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 动物培养及染毒 清洁级雌性Sprague-Dawley大鼠40只，体重（160±10）g，由福建医科大学实验动物中心提供，生产许可证编号：SYXK（闽）2017-0003。饲养条件 ：温度（21±2）℃，相对湿度（68±10）%，自由进食饮水。适应性喂养1周后，随机分成4组，设1个对照组和3个染毒组，根据课题组前期研究［9］的实验结果，对照组吸入正常空气，染毒组分别给予4 212、12 637、37 910 mg·m-3正己烷，在染毒柜中静式吸入染毒，每天染毒4 h，连续28 d。动物实验符合《福建医科大学实验动物伦理委员会章程》（2013）。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 脏器系数 正己烷染毒大鼠28 d后称重，眼眶后静脉采血后处死，剥离肝脏，剔除周边的结缔组织，用滤纸吸干后电子天平称重，记录肝脏湿重（g），计算肝脏脏器系数（%）。取出双侧肾脏称重，计算肾脏脏器系数（%）。

1.2.2.2 病理学观察 取各组大鼠肝脏组织和一侧肾组织，采用4%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇（体积分数70%、80%、90%、95%、100%）脱水，二甲苯透明，制作组织石蜡标本。连续切片，63℃烤片，脱蜡、水化，苏木精染色15 min，盐酸乙醇溶液分化5 s，氨水溶液返蓝1 min，伊红染色5 min，脱水、透明、封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.2.3 测定血清ALT和AST活力、BUN和SCr含量大鼠血液于4℃静置2 h后，转速2 000 r·min-1，离心20 min（离心半径6 cm），再用200 μL移液枪移取上清液1.5 mL至Eppendorf管，置于-20℃冰箱保存。根据ELISA试剂盒说明书，分别检测各组血清中ALT、AST活力及BUN、SCr含量。

1.2.2.4 实时荧光定量PCR法检测CYP1A2、CHOPmRNA的表达情况 每组取其中6只大鼠肝脏的相同小叶部位，切取30 mg大鼠肝脏组织加入1 mL TRIZOL裂解液研磨，移入1.5 mL无核糖核酸酶的 Eppendorf管中，颠倒混匀，室温静止5 min；同样每组取其中6只老鼠相同侧肾脏，切取50 mg肾皮质区组织放入研磨器中，步骤同肝脏组织。按照TRIZOL试剂说明书操作提取总RNA。

依照PrimeScriptTMRT试剂盒说明书操作合成cDNA。按照SYBR@ Premix Ex TaqTM试剂盒说明书操作，于7500型实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应。应用β-actin作为内参，校正各样本的mRNA相对表达量，不同剂量组设置3个复孔。扩增条件：第一步95℃预变性30 s；第二步PCR反应，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。扩增反应结束后，绘制溶解曲线进行扩增产物的特异性分析。反应条件：95℃ 15 s，60℃1 min，95 ℃ 15 s。实 验 重 复3次。β-actin、CYP1A2、CHOP基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，引物序列见表1。

采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。资料经正态性检验后符合正态分布，因此数据以均数±标准差来表示。采用单因素方差分析比较多组间差异，若方差齐性则采用Dunnett-t法将各染毒剂量组与对照组进行比较，若方差不齐则采用 Dunnet’s T3进行两两比较。检验水准α=0.05。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

2 结果

2.1 大鼠体重及肝肾脏器系数

各剂量组大鼠体重呈下降趋势（趋势性检验P＜0.05），其中37 910 mg·m-3正己烷组与对照组相比差异具有统计学意义（P＜ 0.05），各染毒剂量组的肝脏系数及肾脏系数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 正己烷亚急性吸入染毒后大鼠体重及肝肾脏器系数（±s，n=10）Table 2 Body weight and liver/kidney organ coefficient of rats following subacute n-hexane inhalation exposure (±s, n=10)

表2 正己烷亚急性吸入染毒后大鼠体重及肝肾脏器系数（±s，n=10）Table 2 Body weight and liver/kidney organ coefficient of rats following subacute n-hexane inhalation exposure (±s, n=10)

［注］* ：与对照（0 mg·m-3）组相比，P ＜ 0.05。

组别 体重/g 肝脏系数/% 肾脏系数/%0 mg·m-3 235.80±18.56 4.15±0.29 0.74±0.10 4 212 mg·m-3 233.55±20.87 4.09±0.33 0.69±0.06 12 637 mg·m-3 229.58±14.91 4.01±0.30 0.70±0.06 37 910 mg·m-3 211.91±7.05* 3.91±0.27 0.75±0.04

2.2 大鼠肝肾组织病理学观察结果

如图1所示，在光学显微镜下，对照组肝组织的肝小叶呈正常多面棱柱状，分界清楚，肝细胞形态正常一致，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列；4 212 mg·m-3正己烷组的肝细胞体积增大、肝细胞分界模糊，随着染毒剂量的上升，肝小叶分界不清，肝索排列紊乱，窦间隙变窄，肝组织出现明显充血水肿。

如图2所示，对照组大鼠肾组织切片中肾小管结构清晰，染色均匀，排列整齐；4 212、12 637 mg·m-3正己烷组大鼠肾组织切片中肾小管轻微扩张；37 910 mg·m-3正己烷组大鼠肾组织切片中可见部分肾小管上皮细胞水肿，伴有少量肾间质充血。

图1 正己烷亚急性染毒后大鼠肝脏病理学改变（HE染色）Figure 1 Pathological changes in rat liver after subacute exposure to n-hexane (HE staining)

图2 正己烷亚急性染毒后大鼠肾脏病理学改变（HE染色）Figure 2 Pathological changes in rat kidney after subacute exposure to n-hexane (HE staining)

2.3 大鼠血清中ALT和AST活力、BUN和SCr含量的变化

各染毒组血清ALT活力与对照组比较,差异无统计学意义（P＞ 0.05）；37 910 mg·m-3正己烷组血清AST活力高于对照组（P＜ 0.05）；各染毒组血清BUN和SCr含量与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞ 0.05）。见表3。

2.4 大鼠肝脏CYP1A2 mRNA、肾脏CHOP mRNA的表达水平

正己烷各染毒组CYP1A2mRNA相对表达量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。与对照组比较，各染毒组CHOPmRNA的相对表达量均上调，且差异均有统计学意义（P＜ 0.05），见表4。

表3 大鼠正己烷亚急性吸入染毒后血清中ALT和AST活力、BUN和SCr含量的变化（±s，n=10）Table 3 Changes in serum ALT, AST, BUN, and SCr of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=10)

表3 大鼠正己烷亚急性吸入染毒后血清中ALT和AST活力、BUN和SCr含量的变化（±s，n=10）Table 3 Changes in serum ALT, AST, BUN, and SCr of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=10)

［注］* ：与对照（0 mg·m-3）组相比，P ＜ 0.05。

组别 ALT活力/（U·L-1）AST活力/（U·L-1）BUN浓度/（mmol·L-1）SCr浓度/（μmol·L-1）0 mg·m-3 39.44±13.09 72.88±11.59 5.98±0.42 56.38±25.26 4 212 mg·m-3 42.83±13.45 79.52±11.49 6.32±0.48 56.68±4.96 12 637 mg·m-3 45.82±10.81 83.14±9.05 6.73±1.27 58.92±7.19 37 910 mg·m-3 49.42±9.82 93.63±6.84* 6.95±1.32 61.13±9.61

表4 大鼠正己烷亚急性吸入染毒肝脏CYP1A2和肾脏CHOP mRNA表达水平（±s，n=3）Table 4 Expression levels of CYP1A2 mRNA in liver and CHOP mRNA in kidney of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=3)

表4 大鼠正己烷亚急性吸入染毒肝脏CYP1A2和肾脏CHOP mRNA表达水平（±s，n=3）Table 4 Expression levels of CYP1A2 mRNA in liver and CHOP mRNA in kidney of rats exposed to subacute inhalation of n-hexane (±s, n=3)

［注］* ：与对照（0 mg·m-3）组相比，P ＜ 0.05。

组别 CYP1A2 CHOP 0 mg·m-3 1.00±0.06 1.00±0.04 4 212 mg·m-3 0.01±0.00* 2.22±0.19*12 637 mg·m-3 0.08±0.07* 2.05±0.02*37 910 mg·m-3 0.14±0.09* 2.95±0.28*

3 讨论

本研究通过模拟正己烷职业暴露途径，建立静式吸入染毒模型，探究正己烷亚急性染毒对雌性大鼠肝肾的损伤。本实验各剂量组大鼠体重呈下降趋势，未观察到脏器系数的改变。但对大鼠肝脏和肾脏组织病理学观察发现，正己烷染毒后可致肝小叶分界不清，肝索排列紊乱，窦间隙变窄，肝组织出现明显充血水肿，肾脏病理切片出现了肾小管轻微扩张和上皮细胞水肿。

正己烷主要在肝脏内代谢，主要代谢产物为2，5-己二酮、2-己醇和2-己酮等［2］。血清ALT、AST是评价肝功能损伤程度的关键指标［10］，检测肾功能受损时比较敏感的是BUN和SCr这两项指标［11］。本研究结果显示，与对照组比较，37 910 mg·m-3剂量组AST水平差异有统计学意义（P＜ 0.05）。各染毒组染毒后大鼠血清中SCr及BUN含量与对照组相比差异均无统计学意义（P＞ 0.05）。本研究表明，正己烷亚急性暴露可引起大鼠肝功能产生病理损害，而肾功能指标未出现具有统计学意义上的改变，该结果提示，同等条件下可能肝脏对正己烷毒作用的敏感性要高于肾脏。

正己烷职业中毒人群中，女性的比例明显高于男性，以育龄女性为主［12］。国内外研究表明，正己烷染毒可影响内源性性激素雌二醇（estradiol，E2）合成，干扰体内性激素平衡［13］。肝脏也是E2等性激素代谢的主要器官，羟基化是E2代谢的主要方式［14］，CYP1A2在此过程中起重要作用。本研究结果显示，与对照组比较，各染毒组大鼠的肝脏CYP1A2mRNA相对表达量减少（P＜ 0.05）。结果提示，正己烷可抑制肝脏内代谢酶CYP1A2基因的表达，从而影响E2等甾体激素在肝脏内的代谢。

研究表明，不同的肾损伤模型均会触发内质网应激反应，并介导肾脏疾病的发生［15］。CHOP是ERS诱导产生的凋亡信号分子，是ERS细胞凋亡反应的直接结果［16］。Jung等［17］的研究发现，CHOP蛋白在正常细胞中通常很少表达，只有在发生凋亡的细胞中CHOP才被大量转录并翻译。在本次实验中正己烷染毒组与对照组比较，CHOPmRNA表达均上调（P＜ 0.05）。结果提示，本实验条件下，肾功能虽未出现明显损伤，但肾组织可能触发了ERS反应，但其在此时所起的作用需进一步深入研究。

综上，在本实验条件下，正己烷亚急性暴露可引起雌性大鼠肝脏损害，并可抑制肝脏甾体激素代谢酶CYP1A2mRNA的表达。肾功能未出现显著改变，但肾脏组织ERS相关的CHOPmRNA出现明显上调，表明在此条件下亚急性正己烷染毒可能会触发大鼠肾组织ERS反应，但其确切的作用和机制尚需进一步研究。