USP13上调STAT1抑制前列腺癌细胞增殖、克隆和迁移

张 驰,卢 山

(1.南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210023) (2.南京师范大学江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏 南京 210023)

2020年,美国男性新增癌症病例中,前列腺癌(prostate cancer,PCa)以21%的发病率跃居发病率首位,死亡率高达10%,仅次于肺癌和支气管癌[1]. 虽然前列腺癌高发病率主要集中在中南美洲、西欧和北欧以及撒哈拉以南非洲地区[2],但近年来我国前列腺癌发病率也呈明显上升趋势,这和国内高蛋白、高脂肪饮食结构倾向、家族病史影响以及平均寿命延长等密切相关[3]. 寻找和解析影响前列腺癌发生发展的新分子靶标和分子机制迫在眉睫.

USP13是泛素特异性蛋白酶(ubiquitin specific protease,USP)超家族中的一员,其依赖Cys345的催化活性逆转泛素化过程,水解多聚泛素链羧基端的肽键或酯键将泛素链从底物上分离[4]. USP13从N端到C端依次为ND(N-terminal domain)、ZnF(zinc finger domain)、C box(catalytic domain)、UBA1/2(ubiquitin associated domain)和H box(catalytic domain)结构域[5-6]. ZnF结构域能与游离泛素链的C末端结合,激活酶本身的去泛素化活性[7]. 两个串联的UBA1/2结构域是泛素特异性受体. 据文献报道,USP13在不同肿瘤中发挥抑癌或促癌的不同作用[8-11]. USP13在前列腺癌中的作用及调控机理尚未见文献报道. 本研究首先在前列腺癌细胞PC-3和DU145中转染pcDNA3.0-USP13-HA质粒,利用CCK-8法、克隆形成、划痕及Transwell迁移实验分别检测USP13对细胞增殖、克隆和迁移能力的影响;然后,在上述两种细胞中过表达或敲低USP13,采用逆转录PCR(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting)技术分别检测USP13对STAT1转录水平和蛋白水平的调控;同时,在DU145细胞中,过表达或敲低USP13进行Co-IP实验,检测STAT1泛素化水平的变化. 实验结果发现USP13能够通过影响STAT1泛素化水平调节稳定STAT1,可为深入研究USP13在前列腺癌发生、发展中的分子机制奠定基础,还可以为开发前列腺癌治疗药物提供新思路.

1 材料方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株、质粒和细胞

CaCl2法制备的大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞和真核表达载体pcDNA3.0-HA由本实验室保藏;人前列腺癌细胞PC-3和DU145购自上海复祥生物科技有限公司.

1.1.2 主要试剂

HindⅢ-HF(星选酶)、XhoⅠ(星选酶)购自NEB(北京)公司;DNA Marker购自上海捷瑞生物工程有限公司;PrimeSTAR®HS DNA Polymerase 、T4 DNA连接酶购自Takara公司;2×Taq Master Mix、FastPure®Gel DNA ExtractionMini Kit、HiScript®II 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司;去内毒素质粒中提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;RPMI 1640粉末、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;0.25%胰蛋白酶购自德国Capricorn Scientific公司;Lipofectamine®2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;USP13兔一抗、STAT1兔一抗购自Proteintech公司;β-Actin兔一抗购自ABclonal公司;SMURF2鼠一抗、ProteinA/G琼脂糖珠购自Santa Cruz公司;Ubiquitin鼠一抗购自CST公司;pEGFP-N1-USP13真核表达质粒、HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)购自南京巴傲德生物科技有限公司;siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司;青霉素-链霉素溶液(100×)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、兔IgG、小鼠IgG、MG132、RIPA裂解液(强)、Western及IP细胞裂解液、cocktail(磷酸酶抑制剂混合物)、蛋白标准(5 mg/mL BSA)均购自碧云天生物技术有限公司;福林酚购自北京索莱宝科技有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 真核表达重组质粒的构建

参考GeneBank数据库中人USP13基因mRNA序列(NM_003940.3),应用SnapGene v5.2.3软件设计PCR引物,上游引物为5′-CC AAGCTT ATGCAGCGCCGGGGC-3′;下游引物为5′-CC CTCGAG GCTTGGTATCCTGCGGTAAAAGTAC-3′. 按PrimeSTAR®HS DNA Polymerase说明书,以pEGFP-N1-USP13质粒为模板进行PCR扩增,反应体系为50 μL,反应条件为:98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 160 s,共35个循环. PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,用FastPure®Gel DNA ExtractionMini Kit回收,然后用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对USP13基因和pcDNA3.0-HA质粒进行双酶切,将双酶切后的USP13基因和pcDNA3.0-HA质粒按10∶1混合,加入T4 DNA连接酶,16 ℃酶连过夜. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,37 ℃,200 r/min摇菌1 h,将转化后菌液涂布于含氨苄抗性的固体LB平板上,37 ℃培养过夜. 第二天挑取4个单克隆菌落扩大培养,第三天提取质粒并用HindⅢ和XhoⅠ对质粒进行单、双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离,利用凝胶成像系统拍照,根据DNA条带大小判断目的基因是否成功构建到载体上. 最后将重组质粒送通用生物系统(安徽)有限公司测序,将测序结果与NM_003940.3进行序列比对.

1.2.2 质粒或siRNA转染细胞

取约3.5×105个细胞接种于六孔板中,待细胞密度达80%时进行转染. (1)质粒转染时,将A液(100 μL RPMI-1640+2 μg pcDNA3.0-USP13-HA)与B液(100 μL RPMI-1640+3 μL Lipofectamine®2000)分别于1.5 mL EP管中室温静置5 min,将A液加入到B液中混匀,室温静置10 min;(2)siRNA转染时,将C液(100 μL RPMI-1640+100 pmol siUSP13)与D液(100 μL RPMI-1640+5 μL Lipofectamine®2000)分别于1.5 mL EP管中室温静置5 min,将C液加入到D液中混匀,室温静置10 min. 将上述混悬液分别加入待转染细胞中,每孔添加无血清、无双抗1640培养基至2 mL,在转染4～6 h后弃去旧培养基,更换为含5% FBS的1640培养基继续培养至48 h待用.

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖

待细胞转染48 h后,取约2×103个细胞接种于96孔板中,待细胞贴壁后加入10 μL/孔CCK-8溶液;以第一次加入CCK-8溶液的时间点计作0 h,后续按不同时间点(24 h、48 h、72 h)再加入CCK-8溶液,同时用酶标仪测定和记录A549nm吸光值.

1.2.4 克隆形成实验

待细胞转染48 h后,取约2×103个细胞接种于六孔板中,每2～3 d更换一次培养基;待细胞种板7～10 d后进行结晶紫染色:4%多聚甲醛室温固定细胞30 min,1×PBS漂洗3次,每孔加入1 mL 0.1%结晶紫染液室温静置20 min,1×PBS漂洗3次;染色结束后用高清摄像机拍照.

1.2.5 划痕实验

待细胞转染48 h后,取约2×105个细胞接种于12孔板中,待细胞贴壁后使用同一支灭菌的200 μL黄枪头进行划痕,划痕结束后用无菌1×PBS洗去漂浮细胞,置于显微镜下拍照(50×),此时记做0 h;拍照后弃去PBS,加入1 mL含1%血清、不含抗生素的1640培养基继续培养;待第一次划痕24 h、48 h后分别置于显微镜下拍照(50×).

1.2.6 Transwell迁移实验

待细胞转染48 h后,取约4×104个细胞接种于Transwell小室中,上室中加入200 μL细胞悬液,下室中加入500 μL含20% FBS的1640培养基,培养48 h后进行结晶紫染色,染色结束后将小室置于载玻片上,置于显微镜下拍照(50×).

1.2.7 DC法蛋白定量

将蛋白标准(5 mg/mL BSA)用ddH2O稀释至以下浓度:5 mg/mL,2.5 mg/mL,1.25 mg/mL,0.625 mg/mL,0.313 mg/mL,0.156 mg/mL,0.078 mg/mL,0 mg/mL;向96孔板中分别加入5 μL不同浓度的蛋白标准以及待测蛋白样品,设3个重复;按照样品孔数现配现用试剂C(试剂C=试剂A+试剂S,其中V试剂A∶V试剂S=50∶1),每孔加入25 μL试剂C,然后加入200 μL 1×福林酚溶液混匀,室温避光静置20 min;酶标仪755 nm测定吸光值,绘制标准曲线计算出待测蛋白样品浓度. 其中,试剂A为:Na2CO320%+NaOH 5%;试剂S为:CuSO40.25%+酒石酸钠0.5%+SDS 2.5%.

1.2.8 Trizol法提取细胞总RNA

待细胞转染48 h后,每孔加入500 μL Trizol试剂,室温静置5 min,将混悬液转移至1.5 mL EP管中,按Trizol∶氯仿=5∶1的体积比加入氯仿,涡旋15 s后室温静置5 min;4 ℃,12 000 r/min离心15 min,将上层水相转移至新的1.5 mL EP管中,按Trizol∶异丙醇=2∶1的体积比加入异丙醇混匀,室温静置10 min;4 ℃,12 000 r/min离心10 min,弃上清,加入1 mL 75% RNAse Free乙醇清洗RNA;4 ℃,7 500 r/min离心5 min,弃上清,室温静置控干EP管,加入20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA.

1.2.9 逆转录PCR(RT-PCR)法检测mRNA表达

待细胞转染48 h后,采用Trizol法提取细胞总RNA,利用HiScript®II 1st Strand cDNA Synthesis Ki将RNA逆转录为cDNA,具体步骤详见试剂盒内说明书;参考GeneBank中人USP13(NM_003940.3)和人STAT1(NM_007315.4)基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物;按2×Taq Master Mix说明书,以cDNA为模板进行PCR,反应体系为20 μL,反应条件为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,共30个循环;用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带.

1.2.10 蛋白质免疫印迹(western blotting)

待细胞转染48 h后,1×PBS漂洗细胞3次,每孔加入120 μL蛋白裂解液(RIPA裂解液∶苯甲基磺酰氟∶cocktail=9∶1∶0.1),冰上裂解30 min,提取细胞总蛋白;用DC法对蛋白样品进行定量,加入5×蛋白上样缓冲液(5×loading buffer)将蛋白样品配成20 μg/20 μL,95 ℃煮样5 min;取20 μL样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),260 mA恒流湿转100 min,取出聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h,1×PBST(磷酸盐缓冲液+吐温)洗膜3次,一抗4 ℃孵育过夜;1×PBST洗膜3次,二抗室温孵育 1 h,1×PBST洗膜后用ECL化学发光液进行显影,用天能全自动化学发光图像分析系统拍照.

1.2.11 蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)

待细胞转染48 h后,1×PBS漂洗细胞3次,按Western及IP细胞裂解液∶苯甲基磺酰氟∶cocktail=9∶1∶0.1 配置IP裂解液;每孔加入100 μL IP裂解液,将裂解液转移至1.5 mL EP管中,插于冰上,置于摇床上40～50 r/min裂解细胞30 min;4 ℃,12 000 r/min离心20 min,取上清进行DC法蛋白定量,然后分为3组:Input组、IgG组和抗体组;向Input组加入5×loading buffer煮样配置成20 μg/20 μL;分别向IgG组和抗体组加入1 μg IgG抗体和1 μg目的抗体,4 ℃旋转摇床孵育过夜;分别向IgG组和抗体组加入25 μL Protein A/G琼脂糖珠,4 ℃旋转摇床孵育4 h;4 ℃,3 000 r/min离心5 min,弃上清,加入1×PBS,4 ℃旋转摇床漂洗5次,最后一次离心弃干净上清;最后加入25 μL 2×loading buffer,100 ℃煮样5 min,取上清液进行SDS-PAGE电泳.

1.2.12 统计分析

使用Image Pro Plus 6.0和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析和作图,所有实验数据的结果统计均以Mean±标准误差(SEM)表示,使用t检验(t test)分析数据以确定不同组之间的显著差异;*表示P<0.05,**表示P<0.01.

图1 pcDNA3.0-USP13-HA真核表达质粒构建Fig.1 Construction of eukaryotic expression plasmid pcDNA3.0-USP13-HA

2 结果与分析

2.1 构建pcDNA3.0-USP13-HA真核表达质粒

空载体质粒和重组质粒的凝胶电泳鉴定和酶切结果如图1(a)所示,泳道1和2分别为空载体质粒pcDNA3.0-HA和重组质粒pcDNA3.0-USP13-HA的HindⅢ单酶切产物,两条带长度分别为5 448 bp和 7 985 bp;泳道3为重组质粒pcDNA3.0-USP13-HA的HindⅢ和XhoⅠ双酶切产物,产物中USP13条带大小为2 595 bp,由此可见目的基因已构建到载体上. 如图1(b)所示,经测序分析,证实重组质粒pcDNA3.0-USP13-HA构建成功.

2.2 USP13抑制前列腺癌细胞增殖

为了检测USP13对前列腺癌细胞增殖的影响,本研究通过CCK-8法检测过表达USP13的前列腺癌细胞PC-3和DU145在0～72 h期间的细胞增殖变化. 实验结果如图2所示,过表达USP13组细胞生长曲线与对照组有明显差异,说明过表达USP13能够显著抑制前列腺癌细胞增殖能力.

图2 CCK-8法检测细胞增殖Fig.2 Cell proliferation by CCK-8 assay

2.3 USP13抑制前列腺癌细胞克隆形成能力

为了探究USP13对前列腺癌细胞克隆形成能力的影响,本研究在PC-3细胞中过表达USP13,进行克隆形成的观察. 实验结果如图3所示,与对照组相比,过表达USP13组的克隆数显著降低,且形成的克隆较小,说明过表达USP13会抑制前列腺癌细胞的克隆形成能力.

图3 克隆形成实验Fig.3 Colony formation assay

2.4 USP13抑制前列腺癌细胞迁移

为了探究USP13对前列腺癌细胞迁移能力的影响,本研究进行了划痕实验. 结果如图4(a)所示,与对照组相比,无论在PC-3细胞还是在DU145细胞中,过表达USP13均显著降低细胞迁移能力. 对这两种细胞进行Transwell迁移实验,结果如图4(b)所示,再次证实过表达USP13抑制前列腺癌细胞的迁移能力.

2.5 USP13正调控STAT1蛋白水平

为了探究前列腺癌细胞中USP13的下游信号途径,本研究利用PT-PCR检测了USP13过表达对STAT1转录水平的影响,相关引物设计如表1所示. 当PC-3和DU145细胞中分别转染pcDNA3.0-USP13-HA质粒时,实验结果如图5(a)所示.STAT1 mRNA水平未发生变化,说明过表达USP13不影响STAT1转录水平. 利用western blotting检测过表达或敲减USP13条件下STAT1蛋白表达水平,实验结果如图5(b)所示. 当PC-3和DU145细胞中分别转染两种USP13重组质粒(pcDNA3.0-USP13-HA和pEGFP-N1-USP13)时,STAT1蛋白水平均显著上升;反之,当转染siUSP13时,STAT1蛋白水平则明显下降;说明在前列腺癌细胞中USP13正调控STAT1蛋白水平,由此推测USP13可能通过去泛素化作用影响STAT1泛素化水平,进而使胞内稳态STAT1蛋白水平增加.

2.6 USP13降低STAT1泛素化水平

为了确认USP13对STAT1蛋白进行泛素化蛋白酶体降解的影响,本文在DU145细胞中加入蛋白酶体抑制剂MG132条件下,转染USP13重组质粒或siUSP13,进行Co-IP实验. 实验结果如图6(a)所示,与MG132单独处理组相比,USP13过表达显著下调STAT1泛素化水平;与此相反,如图6(b)所示,敲低USP13时,STAT1泛素化水平上升;说明前列腺癌细胞中USP13通过发挥去泛素化酶作用,降低STAT1泛素化水平,从而使胞内稳态STAT1蛋白水平增加.

图4 细胞迁移实验Fig.4 Cell migration assay

表1 RT-PCR引物设计Table 1 Design of RT-PCR primers

图5 USP13正调控STAT1蛋白水平Fig.5 USP13 regulated STAT1 protein positively

图6 USP13降低STAT1泛素化水平Fig.6 USP13 reduced STAT1 ubiquitination

3 结论

本文构建了USP13基因真核表达重组质粒,在前列腺癌细胞PC-3和DU145中转染USP13重组质粒,观察到过表达USP13显著抑制前列腺癌细胞的增殖、克隆和迁移能力. USP13尽管在黑色素瘤、成胶质细胞瘤、肺癌和卵巢癌中起到促癌作用,但在乳腺、膀胱等肿瘤中和本文研究结果相一致,发挥抑癌作用[12].

有文献报道,USP13能够去泛素化调控STING蛋白(与宿主防御病毒有关),水解K27连接的多聚泛素链,阻碍STING招募TBK1到信号复合物上,削弱细胞对病毒的免疫反应[13]. 在肺成纤维细胞中,USP13能够通过去泛素化Smad 4延长其蛋白稳定性,经TGF-β1刺激后,胞浆中的USP13和Smad 4共同转位进入细胞核,上调ECM(extracellular matrix)相关基因的表达以维持细胞外基质分泌[14]. 但在乳腺癌细胞中,过表达USP13显著增加内源性PTEN蛋白表达,且USP13通过去泛素化作用稳定PTEN,从而抑制AKT磷酸化介导的细胞增殖、糖酵解和肿瘤生长[8]. 在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中,USP13也是通过调控PTEN/AKT信号通路发挥肿瘤抑制因子的功能,主要体现在过表达USP13后诱导PTEN上调,并抑制p-AKT激活,在体外抑制OSCC细胞增殖[9]. 而且,在肺腺癌细胞中USP13通过去泛素化作用稳定STAT1蛋白水平,正调控I型和II型IFN信号途径,提高细胞的抗病毒活性[15]. STAT1属于信号转导和转录激活因子家族成员,目前已发现的STAT家族还包含2、3、4、5a、5b和6等. 激活的STAT1和STAT2可诱导产生多种抗病毒蛋白(如Mx1、OAS、IRF-7)抑制丙型肝炎病毒复制,激活的STAT3促进包含肝癌在内的多种肿瘤发生[16]. 但大多数研究表明,激活的STAT1是作为肿瘤抑制因子发挥作用的[17-19]. 有文献报道,BRCC36利用USP13形成一种复合物来拮抗SMURF1介导的STAT1泛素化降解,从而维持纤维肉瘤细胞中稳态STAT1蛋白水平[20]. 本文实验结果发现,过表达或敲低USP13对STAT1转录水平无影响,但对STAT1蛋白水平呈现显著的正调控作用,提示USP13在前列腺癌细胞中可通过上调STAT1进而发挥抑制前列腺癌细胞增殖、克隆和迁移的作用.

通过泛素化Co-IP实验,本文证实USP13在前列腺癌细胞DU145中显著影响STAT1蛋白泛素化水平,说明USP13是通过对STAT1去泛素化,抑制STAT1蛋白泛素-蛋白酶体降解而上调STAT1蛋白. 还有文献报道,USP13中充当泛素特异性受体并发挥催化作用的是UBA1/2域而不是ZnF域,具有较弱的去泛素化功能,仅能水解K63连接的多聚泛素链[21]. 因此,USP13在前列腺癌中是否存在其他作用也值得深入探讨. 另一个重要的去泛素化酶USP5与USP13拥有相似的去泛素化结构域,前列腺癌中USP13是否发挥特异性的STAT1去泛素化作用也值得进一步研究. 此外,由于锌指蛋白Slug可通过抑制E-cadherin表达促进EMT发生[22],在肺癌细胞中,STAT1入核并结合到EMT标志性转录因子Slug的启动子上抑制Slug转录,从而抑制肺癌细胞发生EMT[23]. 据此可以推测,在前列腺癌中,USP13在细胞质中发挥去泛素化酶活性,降低STAT1泛素化水平使胞内稳态STAT1蛋白水平增加,STAT1蛋白能够形成二聚体入核,并结合到EMT标志性转录因子Slug的启动子上抑制Slug表达,从而抑制癌细胞发生EMT,最终表现为USP13抑制前列腺癌细胞的增殖、克隆和迁移,此推测尚有待下一步研究证实.

综上所述,本研究发现USP13能够抑制前列腺癌细胞增殖、克隆和迁移;过表达USP13不影响STAT1 mRNA水平而上调STAT1蛋白水平,反之敲低USP13则下调STAT1蛋白水平;同时,过表达USP13降低STAT1泛素化水平,敲低USP13却提高STAT1泛素化水平. 本研究提示USP13在前列腺癌中可以通过调节STATI蛋白水平影响前列腺癌生长,可为进一步探索USP13在前列腺癌发生、发展中的作用以及开发前列腺癌治疗药物提供新的思路.