槲皮素复合益生元固体饮料的研制及其对小鼠肠道菌群的影响研究

曾钰鹏，李国坤，卢晓丹，丁静华，苏立杰，陈骁熠

（广州医科大学公共卫生学院，广州 511436）

肠道是人体重要器官，对维持健康生命活动具有重要意义。由于不良的饮食习惯和生活作息，肠道疾病如便秘、炎性肠病等发病率越来越高且趋于年轻化［1，2］，而肠道疾病长期发展下去不仅会诱发肥胖、高血压［3］、代谢性疾病［4］，还会导致肠道癌症［5］。肠道疾病常常是由肠道的炎症和肠道菌群的紊乱引起的［6］，抑制肠道炎症和调节肠道菌群是治疗肠道疾病的关键，而常规的药物治疗副作用大，且疾病易复发，通过膳食中的天然活性物质抑制肠道炎症和调节肠道菌群［7］，为有效预防和治疗肠道疾病提供新思路。

槲皮素（Quercetin）被认为是预防和治疗多种慢性疾病的一种重要天然活性物质，其来源广泛［8］且提取简单，不仅具有抗氧化、抗癌、抗炎、调节免疫及保护心血管等作用［9］，还对肠道菌群有调节作用。槲皮素能改善微生物多样性减少趋势，增强潜在有益微生物丰度［10］，调节肠道菌群失衡状态，促进宿主恢复微生物平衡。另外，槲皮素具有保护肠屏障的作用［11］，通过抑制肠道细菌脂多糖的产生，减少脂多糖对肠屏障的刺激，从而降低炎症反应。虽然槲皮素对人体健康具有多种有益作用，但中国居民槲皮素每日人均摄入量不超过10 mg［12］，无法达到理想的保健效果，因此研制槲皮素功能食品具有重要意义。

槲皮素虽然能有效抑制有害菌的生长［13］，但对有益细菌生长的增殖作用不如益生元显著。而低聚果糖（Fructo oligosaccharide，FOS）作为一种常见的益生元，不仅能有效促进双歧杆菌［14］、乳杆菌［15］的增殖，还能抑制肠杆菌［16］、产气荚膜梭菌等有害菌生长，从而靶向调节肠道菌群结构，达到调整肠道微生态［17］、预防肠道感染、改善排便等作用。另外，低聚果糖还具有增强细胞免疫和体液免疫功能、抗过敏、促进矿物元素吸收、降低血液胆固醇及血脂浓度、减少肿瘤风险等多种功能［18］，是理想的保健食品。因此将槲皮素和低聚果糖复合，使其对肠道有害菌生长的抑制作用更加明显，对有益菌生长的扶植作用更加有效。

目前，关于槲皮素功能食品研发的报导非常少，以槲皮素和低聚果糖为原料，研制一款槲皮素复合益生元固体饮料，使该固体饮料既具有改善肠道健康的功能，又为槲皮素补充提供一个新渠道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲皮素，西安天丰生物科技股份有限公司；低聚果糖、羧甲基纤维素（Carboxymethyl cellulose，CMC）、柠檬酸，市售食品级；乳酸杆菌选择性培养基，青岛海博生物科技有限公司；伊红美蓝琼脂培养基、胆盐七叶苷琼脂培养基、双歧杆菌琼脂培养基、营养肉汤，广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱，上海瑞丰仪器仪表有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；迅数自动菌落分析仪，杭州迅数科技有限公司；电子天平，普利赛斯科学仪器有限公司；MULTISKAN GO全自动酶标仪，赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 主要工艺流程 配料→过筛→混合→检验→包装→成品。

1.3.2 槲皮素复合益生元固体饮料的感官评分 标准评定小组由10人组成，根据色泽、组织形态、气味、滋味4方面进行综合评分，总分为100分，其中色泽、组织状态、气味、滋味各占25%。按评分标准对各个配方结果打分，取平均值作为最终分数，评分标准见表1。

表1 感官评分标准

1.3.3 配方优化试验设计 以感官评价为指标，对低聚果糖添加量、槲皮素添加量、柠檬酸添加量和羧甲基纤维素钠添加量进行考察，通过单因素试验和正交试验选择最优配方。

1.3.4 产品检验 水分检测参照GB 5009.3《食品安全国家标准 食品中水分的测定》第一法直接干燥法；参照GB/T 4789《食品安全国家标准 食品微生物学检验》检测固体饮料中的菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母。

1.3.5 槲皮素复合益生元固体饮料对小鼠部分肠道菌群的影响 分别探讨低聚果糖、槲皮素和最佳配方固体饮料对小鼠部分肠道菌群的影响。选取肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌4类细菌作为研究对象，这4类细菌也是《保健食品检验与评价技术规范（2003版）》中用于评价受试样品是否具有调节肠道菌群的作用细菌。

1）选择培养基的配制。按照培养基配制方法分别配制胆汁七叶苷琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、双歧杆菌选择培养基、乳酸杆菌选择培养基。

2）样本的稀释及细菌培养条件的确定。无菌取小鼠粪便，用无菌水梯度稀释至10-4后，分别接种于对应的选择培养基上进行培养，培养条件见表2。选择性培养并鉴定，剔除不符合条件的菌落，其余菌落以无菌水冲洗后收集，得到目标菌种。

表2 细菌培养条件

3）菌落的鉴定。参考《伯杰氏系统细菌学手册》第九版对肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌的描述，对分离所得菌种菌落形态和微生物形态学特征进行鉴定。

4）光电比浊法测定吸光度（OD）。将0.5麦氏浊度的目标菌种（肠球菌、肠杆菌、双歧杆菌、乳杆菌）以10%的接种量接种于含有适量样品的营养肉汤中，取200 μL置于96孔板中，37℃厌氧培养。以空白营养肉汤为对照，分别做3个平行样，于600 nm波长下测定其吸光度（OD600nm）。每2 h测定1次，共检测24 h。

1.4 数据统计分析

运用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计分析。试验结果采用均数±标准差（x±s）进行统计描述。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 低聚果糖添加量对产品感官品质的影响 以40℃温水100 mL冲调，固定槲皮素0.4 g、柠檬酸0.05 g、CMC 0.15 g，探究低聚果糖添加量为 4、6、8、10、12 g对产品感官质量的影响，感官评分结果见图1。由图1可知，感官评价分数在低聚果糖添加量为8 g时，感官评分最高，说明在该条件下，饮料酸甜可口、口感最佳。

图1 低聚果糖添加量对感官评分的影响

2.1.2 槲皮素添加量对产品感官品质的影响 以40℃温水100 mL冲调，固定低聚果糖8 g、柠檬酸0.05 g、CMC 0.15 g，探究槲皮素添加量为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g对产品感官质量的影响，感官评分结果见图2。由图2可知，感官评价分数在槲皮素添加量为0.4 g时，感官评分最高，槲皮素添加量少时，产品槲皮素清香不明显；添加量大时，饮料的色泽、口感皆变差。

图2 槲皮素添加量对感官评分的影响

2.1.3 柠檬酸添加量对产品感官品质的影响 以40℃温水100 mL冲调，固定低聚果糖8 g、槲皮素0.4 g、CMC 0.15 g，探究柠檬酸添加量为 0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g对产品感官质量的影响，感官评分结果见图3。由图3可知，感官评价分数在柠檬酸添加量为0.05 g时，感官评分最高，说明此时酸味与甜味恰到好处、味道和谐，添加量过高或过低皆会导致滋味不佳。

图3 柠檬酸添加量对感官评分的影响

2.1.4 CMC添加量对产品感官品质的影响 以40℃温水100 mL冲调，固定低聚果糖8 g、槲皮素0.4 g、柠檬酸0.05 g，探究CMC添加量为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g对产品感官质量的影响，感官评分结果见图4。由图4可知，感官评价分数在CMC添加量为0.15 g时，感官评分最高，说明此时产品乳化效果、稳定性最佳，口感最好。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，按40℃温水100 mL冲调，以感官评价为指标，选取低聚果糖添加量、槲皮素添加量、柠檬酸添加量和羧甲基纤维素添加量进行L9（34）正交试验，正交试验因素与水平见表3，正交试验结果见表4。由表4可知，各因素对感官评价的影响存在差异，影响大小依次为低聚果糖添加量（A）＞槲皮素添加量（B）＞柠檬酸添加量（C）＞羧甲基纤维素添加量（D），极差分析结果表明最优方案为A2B2C3D2，即低聚果糖添加量8 g，槲皮素添加量0.4 g，柠檬酸添加量0.06 g，羧甲基纤维素添加量0.15 g。

图4 CMC添加量对感官评分的影响

表3 正交试验因素与水平

表4 正交试验结果

2.3 产品检验

产品检验结果见表5。

表5 相关产品检验

2.4 菌种鉴定结果

如图5所示，肠球菌革兰氏染色为阳性，菌落较小、圆形、表面光滑、不透明，周围有褐色圈；肠杆菌革兰氏染色为阴性，菌落中等大小、紫黑色、有金属光泽，菌落呈圆形；双歧杆菌革兰氏染色为阳性，菌落中等大小、瓷白色、边缘整齐光滑，菌落呈圆形；乳杆菌革兰氏染色为阳性，菌落中等大小、凸起、微白色，菌落呈圆形。

图5 菌种菌落形态

2.5 槲皮素复合益生元固体饮料对肠道菌群体外增殖的影响

按照正交试验得到的最佳配方用100 mL水冲调后，按照10%的添加量加入营养肉汤，接种目标菌后，通过光电比浊法测定OD值，研究固体饮料的主要原料低聚果糖和槲皮素，以及最佳配方固体饮料对肠道菌群体外增殖的影响。

2.5.1 对肠球菌体外增殖的影响 如图6所示，低聚果糖、槲皮素和10%饮料组的OD值没有空白组的增幅大，且都在16 h达到平缓，说明低聚果糖、槲皮素和槲皮素复合益生元固体饮料都对肠球菌的增殖有抑制作用。

图6 低聚果糖、槲皮素和固体饮料对肠球菌的增殖影响

2.5.2 对肠杆菌体外增殖的影响 如图7所示，低聚果糖、槲皮素和10%饮料组的OD值在6 h后增幅减小且趋于平缓，而空白组OD值增幅没有明显减小趋势，说明低聚果糖、槲皮素和槲皮素复合固体饮料对肠杆菌的增殖有抑制作用。

图7 低聚果糖、槲皮素和固体饮料对肠杆菌的增殖影响

2.5.3 对双歧杆菌体外增殖的影响 如图8所示，低聚果糖组平缓期OD值远远高于空白组，槲皮素组平缓期OD值低于空白组，而槲皮素复合固体饮料平缓期OD值高于空白组，说明槲皮素复合固体饮料对双歧杆菌的增殖有促进作用。

图8 低聚果糖、槲皮素和固体饮料对双歧杆菌的增殖影响

2.5.4 对乳杆菌体外增殖的影响 如图9所示，低聚果糖组平缓期OD值远远高于空白组，槲皮素组平缓期OD值低于空白组，而槲皮素复合固体饮料平缓期OD值高于空白组，说明槲皮素复合固体饮料对双歧杆菌的增殖有促进作用。

图9 低聚果糖、槲皮素和固体饮料对乳杆菌的增殖影响

3 结论

通过单因素试验及正交试验确定槲皮素复合益生元固体饮料的最佳配方为低聚果糖添加量8 g、槲皮素添加量0.4 g、柠檬酸添加量0.06 g、羧甲基纤维素添加量0.15 g，冲调水为100 mL；最佳配方所得槲皮素复合益生元固体饮料能明显抑制肠球菌和肠杆菌的增殖，也能有效促进双歧杆菌和乳杆菌的增殖，为槲皮素功能食品的开发利用提供了理论依据。