一株桑树根际促生菌的筛选鉴定及促生性能研究
2021-02-22杨统一杜秋霞刘静霏翟德丽刘延鹏赵卫国
杨统一 ,杜秋霞,刘静霏 ,翟德丽 ,刘延鹏 ,赵卫国 ,2
(1.江苏科技大学,江苏 镇江 212018;2.中国农业科学院蚕业研究所,江苏 镇江 212018)
土壤质量状况决定了桑树的产量和品质,当前由于不合理的农艺措施如过量施用化肥,造成土壤酸化及板结,土壤微生态失衡,致使桑树产出减少、品质下降,这促使人们寻找其他肥料来代替化肥。大量研究发现植物生长促进菌(plant growth-promot⁃ing bacteria,PGPB)能够通过代谢活动活化土壤营养物质,促进植物吸收营养、加快生长等[1,2]。而应用富含活性PGPB的微生物肥料有利于修复土壤生态系统的平衡,恢复土壤肥力,引起了人们的广泛关注。研究表明,PGPB能够通过直接和间接两种途径来促进作物生长[3],直接作用如分泌植物激素促进生长,分泌有机酸促进难溶磷转化成有效磷,分泌固氮酶等增加土壤肥力,而间接作用包括诱导作物产生抗性、直接与病原菌拮抗等[4,5]。PGPB 作为微生物菌肥的菌种,可持续性较好,对环境和食品安全,还可以改善土壤结构,提高土壤有机质含量,在生态环境保护、绿色有机食品生产及农业可持续发展中发挥着重要作用[6,7]。
目前菌肥效果研究发现在众多农作物上具有良好的应用效果,包括小麦、水稻及玉米等[8-10],而在桑树中施用微生物菌肥也能提高桑树枝条生长量及叶片生物量。高绘菊等[11]研究发现桑树内生拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L144的培养液能明显提高玉米和桑树种子的发芽势、发芽率和胚根长,增加玉米及桑树幼苗的株高及植株生物量,提高叶绿素等含量。梁灏琳等[12]在研究3种微生物菌剂对桑树的应用时发现,菌剂能较好地促进桑树茎干生长、叶片增绿及土壤改良。罗海信[13]研究了菌肥对桑树生长发育的影响,发现桑园施用生物肥料能够显著提高桑叶的产量,并能够提高桑椹的产量和品质。目前影响PGPB菌肥应用的关键问题之一就是优良菌种的筛选与培育,但是开发桑树生长促进菌优良菌株的研究还较少。本研究从中国农业科学院蚕业研究所镇江桑树圃的桑树根际土壤中筛选并鉴定了一株能够溶磷和分泌IAA的植物根际促生菌,考察了不同pH、培养时间对菌株促生能力的影响,以期为桑树专化型微生物菌肥的开发利用提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 供试土壤
采用抖动法采集江苏科技大学西校区蚕业研究所桑园根际土壤,混匀,置于4℃冰箱中保存备用。
1.2 培养基的配制
基础培养基(LB):蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,去离子水定容至 1 000 mL,琼脂 20 g,pH 7.2~7.4;液体培养基不加琼脂。
PKO培养基(无机磷培养基):Ca3(PO4)25 g,C12H22O1110 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.1 g,MgSO4·7 H2O 0.1 g,KCl 0.2 g,MnSO40.03 g,FeSO4·7 H2O 0.03 g,酵母菌膏0.5 g,去离子水定容至1 000 mL。pH 7.0~7.2。固体培养基加琼脂15 g/L。
1.3 促生菌筛选与鉴定
1.3.1 溶磷菌株的筛选 采用平板稀释分离法[8],称量5 g土壤样品用45 mL灭菌的生理盐水制备成土壤悬液,经梯度稀释后成10-2~10-4浓度土壤稀释液,取0.1 mL均匀涂布于无机磷培养基平板上,置于30℃培养箱中培养3~7 d后,挑取有溶磷圈的菌株,进行纯化和多次传代后,4℃保存备用。
1.3.2 菌株的鉴定
1)形态学观察与鉴定。扫描电镜成像(SEM):收集对数期生长的菌体并用生理盐水洗涤两次,用甲醇和乙酸(3∶1)固定2 h。后依次用50%、70%、85%、90%和100%乙醇依次处理20 min,最后将处理好的样品送学校分析中心进行扫描电子显微镜(SEM)成像。
2)菌株形态和生理生化特征鉴定。参照微生物学实验和伯杰氏鉴定手册进行菌株的形态和生理生化特性鉴定。
1.3.3 分子生物学鉴定 挑取少许菌株接种于LB液体培养基中,30℃、120 r/min振荡培养至菌液OD600nm为0.8。取2mL菌液离心后收集菌体。采用煮沸法[14]滴加0.5 mL去离子水于菌体中,涡旋30 s,100℃下水浴5 min,12 000 r/min离心2 min。上清液即为DNA模板,在-20℃下保存。然后用细菌通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行 16S rDNA扩增[15]。扩增条件为:预变性5 min(95 ℃);进入循环,变性30 s(94 ℃),退火30 s(55℃),延伸90 s(72℃),运行30个循环;最后72℃温度下延伸10 min,4℃条件下保存。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,将检测合格的PCR产物送至上海Invitrogen公司测序。将测序结果与GenBank数据库中已有的16S rDNA序列用Blast软件进行比对,然后用MEGA 6.0软件构建出菌株的系统进化树。
2.1.2 抑郁症组 选取我院同期收治的抑郁症住院患者作为抑郁症组。纳入标准:符合《中国精神疾病分类与诊断标准第3版(精神障碍分类)》[15]中抑郁症的诊断标准,汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分≥20分[16]。排除标准:妊娠期或哺乳期妇女;具有器质性精神障碍或者由精神活性物质所致的精神障碍者;严重心、肝、肾等实质性脏器损害者;神经系统变性疾病患者;语言听力功能障碍者。该组共纳入抑郁症患者85例。
1.3.4 筛选菌株促生能力的测定
1)溶磷能力的测定[4]。用接种环挑取少许纯化的溶磷菌加入50 mL液体LB培养基,在30℃下120r/min摇床培养至菌液吸光值OD600nm为0.8时,作为种子液,此时菌体浓度约109个/mL。将1 mL种子液接种于50 mL PKO液体培养基中,30℃、120 r/min下,分别培养6、18、30、48、72 h后,取5 mL样品,4 ℃下10 000 r/min离心15 min。取上清液定容至25 mL后加入显色剂,每组3个平行,通过钼锑抗比色法测定菌株的溶磷能力。
液体PKO培养基的pH对有效磷的影响测定:配制pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的液体PKO培养基,分别培养24 h取样,按照上述方法测定菌株的溶磷能力。
2)产IAA能力的测定。对细菌分泌IAA的能力定量测定时使用分光光度法进行[5]。标准曲线的绘制采用分析纯的IAA梯度稀释制备。将200 μg/mL的 IAA 标准液稀释为 0、25、50、75、100、125、150、175 μg/mL,采 用 Salkowski显 色 法 测 定 吸 光 值(OD530nm),然后制作标准曲线。
挑取少许菌体接种于LB液体培养基,在30℃下120 r/min摇床培养至菌液吸光值OD600nm为0.8时作为种子液。将0.5 mL种子液接种于含有100 mg/L L-色氨酸的50 mL LB液体培养基中,30℃、120 r/min摇床培养下,培养至6、18、30、48、72 h时,各取1 mL样品,然后12 000 r/min离心10 min,取100 μL上清液加入等体积Salkowski比色液,混匀后避光静置30 min后测定其OD530nm,以不加L-色氨酸的LB培养基作为空白对照。参照标准曲线计算单位体积菌液IAA的含量。
LB液体培养基pH对IAA分泌量的影响测定:配制pH为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的液体LB培养基,按照上述方法分别计算菌液分泌IAA的量。
1.4 菌株促生效果的盆栽试验
盆栽试验的土壤来自中国农业科学院蚕业研究所国家种质镇江桑树圃,土壤的pH为7.5,有机质含量2.9 g/kg,全氮含量0.083%,速效氮含量97.4 mg/kg,总磷含量 659 mg/kg,速效磷含量 3.69 mg/kg[16]。土壤可培养微生物指标中,细菌用牛肉膏蛋白胨培养基培养,放线菌用高氏一号培养基培养,真菌用察氏培养基培养[17]。土壤中细菌数量为(8.3±0.52)×105/g干土,真菌数量为(5.7±0.64)×104/g干土,放线菌数量为(2.4±0.4)×105/g干土(注:数据为平均数±标准差)。
挑选饱满一致的桑树种子,用50℃温开水浸泡,水凉后浸泡12 h。催芽后育苗,等长出两叶一心时移栽定植。选取长势一致的健康桑树苗移栽于塑料盆(含200 g风干土壤)中,等桑苗定植一周后,采用灌根法接种促生菌。将筛选出的菌株利用LB液体培养基37℃培养48 h,8 000 r/min离心5 min,去除上清液,无菌水重悬菌体备用。灌根的G2菌液为无菌水重悬至OD600nm为0.8时,此时菌体浓度约109个/mL。处理组为无菌水对照(CK)、稀释100倍(约含菌体107个/mL)和200倍(约含菌体0.5×107个/mL)的种子液,每处理5次重复,每盆灌根50 mL。
桑树苗长出四叶一心时,测量试验组和对照组桑树的株高、鲜重,然后小心剥离土壤后105℃烘干至恒重,称量地上部干重和根系干重。
1.5 数据处理
数据的统计分析运用Excel及SPSS 16.0进行。
2 结果与分析
2.1 促生菌株G2的筛选及生理生化鉴定
由图1a革兰氏染色结果可知,筛选出的G2菌株是一种革兰氏阴性菌;由图1b可知,G2菌是一种杆菌,大小约为0.5 μm×1.5 μm;由图1c、图1d可以证实,G2菌具有溶磷及分泌IAA的能力。
图1 G2菌形态及其他特征
G2菌的生理生化测试结果见表1。由表1可知,G2菌没有发酵乳糖、葡萄糖及甘露醇的能力;过氧化氢酶阳性,而苯丙氨酸脱氢酶阴性,不能水解淀粉等。
表1 G2菌的生理生化测试结果
2.2 菌株G2的16S rDNA分子鉴定
G2菌的16S rDNA扩增后进行测序,将序列提交GenBank获得登录号KT283101。利用Blast进行序列同源性分析,用MEGA 6.0软件构建菌株的系统发育树,结果见图2。由图2可知,G2菌株与Pseu⁃domonas stutzeri具有99%以上的相似性,初步鉴定菌株G2为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
2.3 pH和时间对菌株溶磷性能的影响
由图3可知,不同pH显著影响菌株G2的溶磷性能。随着pH的升高,G2菌株的溶磷量表现出先升高后降低的趋势,在pH为7左右时,达到最大值(13.53 mg/L)。
将G2菌株用PKO培养基培养3 d,每隔一定时间取样测定上清液中有效磷的含量,结果如图4所示。从图4可以看出,刚开始菌株可能处于生长适应期,有效磷的含量比较低。随着培养时间的延长,菌株溶解磷的含量增加。48 h左右时溶解磷含量达到最大值,为17.96 mg/L。
图2 菌株G2及相关菌株基于16S rDNA的系统发育树
图3 pH对菌株溶磷性能的影响
图4 培养时间对菌株溶磷性能的影响
2.4 pH和时间对菌株分泌IAA性能的影响
由图5可知,在pH为4和10时,菌株分泌IAA的含量较低。在pH为5、6及7时,菌株IAA分泌量最多,没有显著差异;随着pH超过8,菌体IAA分泌量逐渐减少。综合表明菌株在pH 5~8时,分泌IAA的能力都较强,但总的来说,G2菌株较适应偏酸性的环境。
从图6可知,菌株分泌IAA的能力自6 h快速提高,处于快速增长阶段,并于48 h达到115.1 mg/L,也就是说48 h之前IAA增加速度较快;48 h后IAA含量还在增加,但增加速度较慢,至72 h时达到121.7 mg/L。这可能是由于后期营养比较匮乏,种内竞争加剧,导致IAA分泌速度减缓。
图5 pH对菌株分泌IAA能力的影响
图6 培养时间对菌株分泌IAA能力的影响
2.5 对桑树苗盆栽的促生效果
由表2可知,该菌株对桑树苗的根系及茎叶都有促进作用。其中以稀释100倍处理促生效果最佳,各项指标值均较对照提高30%以上,与对照相比,差异达到显著水平。
表2 不同处理对桑树苗生物学特征的影响
3 小结与讨论
试验从土壤中分离得到了一株兼具溶磷和分泌生长素IAA两种能力的植物根际促生菌G2,经过形态学特征观察、生理生化特性鉴定、16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为施氏假单胞菌。在pH为7时,G2菌株的溶磷能力最佳,而pH为5~7时G2菌株IAA的分泌量最大。培养时间为48 h时,G2菌株的溶磷能力达到17.96 mg/L;而IAA含量72 h时达到121.7 mg/L。盆栽试验表明,接种筛选的促生菌G2后,桑树苗的株高、鲜重、地上部干重及根系干重分别较对照提高31.8%、38.5%、34.6%及31.2%。
当前中国桑产业逐步从东部沿海地区向西部地区转移,随着果桑新品种的推出,使桑树不仅能够提供桑叶,还能提供营养价值丰富的桑果,为实现农村和农民的增收起到积极作用,有利于农村发展休闲旅游产业。由于长期的不良农业措施,如农药、化肥的大量施用不仅使土壤质量下降还破坏了农田生态系统的平衡,从而导致植株生长缓慢、发病率升高等现象[17]。PGPB通过定植于根部,能够改变土壤微环境,活化难以吸收的营养物质,改善营养状况,还能够挤占有害病原菌的生态位,促进植物生长。在桑树生长期间,微生物菌肥不仅能为桑树的生长提供所需的养分,改善桑叶品质,进而实现蚕桑副产物的优质高产,而且还可提高肥料利用率,降低养蚕成本,提高经济效益。因此,微生物菌肥可以作为桑园的优质肥源之一。而获得优良的微生物菌种是开发高效菌肥的前提。
目前,报道的PGPB有众多种属,包括芽孢杆菌属、假单胞菌属、微杆菌属及土壤杆菌属等[7,18,19]。假单胞菌属的促生机制包括提高养分的可利用性,分泌促生长的激素,还可以分泌拮抗病原菌的物质来提高植物的抗病性[20,21]。李娜等[22]从石灰性土壤中分离筛选出一株高效溶磷的假单胞菌W05,制成的溶磷菌肥显著提高了土壤有效磷含量和磷酸酶活性。刘润进等[23]将AMF和PGPB(荧光假单胞菌)混匀制备成组合菌剂,显著降低了土壤中甲胺磷残留量。本研究从江苏科技大学蚕业研究所的桑树根际土中筛选得到一株具有解磷及分泌生长素能力的细菌,经过16S rDNA测序比对,鉴定为施氏假单胞菌。进一步研究表明,该菌在pH 5~8时,具有较好的分泌生长素的能力,说明该菌株能够适应的土壤pH范围较广。
目前研究发现PGPB的促生效应在植物的幼苗期具有较好促进作用。小麦幼苗在接种假单胞菌HP1218后,在株高及根长方面比对照增加13.2%及20.4%[9]。邢丹等[24]以桑品种桑特优 2号为研究对象,接种两种丛枝菌根真菌(摩西斗管囊霉及根内根孢囊霉)都显著增加了桑树株高、地径、叶面积、地上部分和根系干质量。本研究发现,接种稀释100倍的促生菌G2菌液后,桑树苗的株高、鲜重、地上部干重及根系干重分别较对照提高31.8%、38.5%、34.6%及31.2%。已有研究表明PGPB从两个方面起到促生作用:一是能够产生植物生长激素如IAA、细胞激动素等;另外一个方面可以促进植物对氮、磷等营养元素的吸收。本研究表明G2菌株能分泌IAA及具有较强的溶磷能力。结合G2菌株的促生能力研究,其对桑树苗的促生作用可能是IAA增加及促进磷吸收这两个方面的综合作用结果。本试验仅考察了该菌对盆栽的桑树苗促生作用,至于该菌能不能在田间应用时验证促生效果及促生效果能持续多长时间还需要进一步的研究,为以后制备促生菌剂提供参考。