猪伪狂犬病病毒安徽分离株对小鼠的致病性研究

李春芬，何赞赞，杨龙斌，何长生，占松鹤，孙 裴，魏建忠，李 郁

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036；2.巢湖市畜牧兽医中心，安徽 巢湖 238000；3.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽 合肥 230091）

猪伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的一种高度接触性传染病[1]。一般成年猪呈隐性感染，可导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎，种猪不育，15日龄内的仔猪病死率高，肥育猪呼吸困难、生长停滞、增重缓慢等。PR呈世界性分布，是危害全球养猪业的重大传染病之一。世界动物卫生组织（OIE）将PR列为必须通报的动物疫病，我国农业农村部将PR列为二类动物疫病，同时PR也是我国《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中优先防治的动物疫病，要求到2020年底全国所有种猪场达到净化标准。

疫苗免疫接种是预防和控制PR的根本措施，以净化猪群为主要手段。20世纪90年代以来，随着PR基因缺失疫苗（Bartha-K61株）的引入并广泛使用，PR在我国大部分地区得到有效控制[2]。但自2011年以来，我国各地均有PR疫情的报道[3-5]，给养猪业造成了严重的经济损失。安徽地区猪群中PRV的感染率也呈现逐年上升趋势[6-7]，可临床流行毒株的致病性、与疫苗株之间的匹配性等目前尚不清楚。本研究在从安徽不同地区疑似PRV感染病猪中分离鉴定的13株PRV基础上，以小鼠为动物模型，通过对13株PRV安徽分离株的半数致死量（LD50）测定、病理剖检和病理组织学观察以及各组织脏器的病毒载量检测，了解和掌握PRV安徽分离株的毒力特征，从而为深入研究PRV安徽分离株的抗原性奠定基础，为安徽地区PR的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2016年1月至2018年12月在安徽农业大学动物传染病研究室进行。

1.2 毒株、细胞及试验动物

13株PRV安徽分离株（代号为AH1601～AH1604、AH1701～AH1704、AH1801～AH1805）由安徽农业大学动物传染病研究室分离、鉴定[8]；Vero细胞由安徽农业大学动物传染病研究室保存；455只体重为18～22 g清洁级昆明雌性小鼠购自安徽医科大学动物实验中心。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM培养液、2×SuperStar Plus High-GC PCR Mix、DL 2000 DNA Marker。荧光定量PCR仪、PCR扩增仪、凝胶成像系统、超高速离心机。

1.4 半数致死量（LD50）的测定

在13株PRV安徽分离株中，每株为1组，共计13组（编号为1～13）。以第1组（代号为AH1601的PRV安徽分离株）为例说明。将AH1601半数组织培养感染剂量（50% tissue culture infective dose, TCID50）为106/mL进行10倍递增稀释，取6个不同释梯度（106～101TCID50）的病毒液编号为1A～1F。35只小鼠随机分成7组（编号1A～1F和G），每组5只。试验组1A～1F，颈部皮下注射对应的不同稀释度PRV，0.1 mL/只；对照组G，以相同的接种途径和剂量注射DMEM细胞培养液。在适宜环境下每组小鼠分别隔离饲养。持续观察1周并记录小鼠的精神状态及死亡情况，按照Reed-Muench法计算AH1601的LD50。

1.5 病理剖检及病理组织学观察

经1.4攻毒后观察各组小鼠精神状态，分别取第1～13组PRV攻毒剂量为106TCID50（试验A组）小鼠，依次标记为1A～13A，对照组小鼠标记为G，剖检小鼠观察各脏器病变，并采集小鼠的脑组织及肺、肝、脾和肾脏于10%福尔马林溶液中，24 h后重新更换福尔马林，进行固定和保存，之后送至安徽医科大学制备病理组织切片，显微镜观察，比较各组织病变程度。

1.6 感染小鼠各组织脏器中PRV载量的检测

经1.4攻毒后，分别取第1～13组PRV攻毒剂量为106TCID50（试验A组）小鼠，采其脑组织及肺、肝、脾和肾脏于1.5 mL研磨管，称重记录（各组织重约100 mg），按照一定体积比（1∶5）加入无菌PBS缓冲液进行研磨，提取各组织核酸，利用安徽农业大学动物传染病实验室建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测PRVgE基因的方法，对各脏器组织进行PRV载量的检测。

2 结果与分析

2.1 LD50的测定结果

1 3株PRV安徽分离株对小鼠的LD50在102.569～105.167TCID50之间，不同毒株对小鼠致病力大小各有差异，其中AH1802和AH1803对小鼠的致病力最强，LD50分别为102.569TCID50和102.833TCID50，AH1603和AH1703对小鼠的致病力最弱，LD50均为105.167TCID50（表1）。

表1 13株PRV安徽分离株对小鼠的LD50测定结果

2.2 病理剖检及病理组织学观察结果

在LD50的测定中，对照组小鼠均健活，试验组小鼠死前出现精神沉郁、食欲下降、呼吸加快等现象。部分小鼠出现典型的PR症状：奇痒、啃咬注射部位，致使局部被毛脱落、皮肤出血，随后四肢麻痹，倒地不起，最后衰竭死亡。剖检死亡小鼠可见肝、脾、肺、肾脏及脑等部位均有不同程度的出血、肿大，对照组无异常变化。病理组织HE检查结果如下。

2.2.1 脑部 对照组G结构正常，未见明显病理变化。试验组1A、3A未见明显病理变化；2A少量炎症细胞浸润；4A脑血管轻微充血；5A、7A、8A少量炎症细胞浸润；6A轻微病毒性脑炎；9A大量炎症细胞浸润，脑水肿；10A病毒性脑炎，大量炎症细胞浸润；11A病毒性脑炎，脑水肿；12A轻微脑炎，出血；13A病毒性脑炎，脑水肿（图1）。结果表明，AH1801、AH1802、AH1803感染小鼠脑组织病理变化较为严重。

2.2.2 肺脏 对照组G整体结构正常，肺泡结构清晰，肺泡壁无明显增厚，组织未见明显炎症细胞浸润。试验组1A轻微出血，少量炎症细胞浸润；2A炎症细胞浸润，肺泡壁增厚；3A少量炎症细胞浸润；4A肺动脉充血；5A炎症细胞浸润；6A、9A肺泡壁轻微增厚；7A肺泡腔变小；8A肺动脉血管充血，组织间隙轻微出血；10A肺脏出血、肺泡内出血；11A炎症细胞浸润；12A肺动脉充血，肺泡壁增厚；13A肺脏出血，弥漫性炎症细胞浸润（图2）。结果表明，AH1802、AH1803、AH1804、AH1805感染小鼠肺脏组织病理变化较为严重。

图1 各组小鼠脑组织病理组织学观察（HE染色，20×）

图2 各组小鼠肺脏病理组织学观察（HE染色，20×）

2.2.3 肝脏 对照组G整体结构正常，中央静脉轮廓清晰，肝细胞结构饱满，肝索沿着中央静脉放射状排列。试验组1A淤血；2A中央静脉充血；3A无特征性明显病变；4A肝窦间隙轻微增宽，组织少量炎症细胞浸润；5A少量炎症细胞浸润；6A炎症细胞浸润；7A出血，充血；8A少量炎症细胞浸润；9A充血；10A肝细胞排列紊乱，空泡性变性；11A炎症细胞浸润，肝水肿；12A肝窦间隙轻微增宽；13A少量炎症细胞浸润（图3）。结果表明，AH1702、AH1802、AH1803感染小鼠肝脏组织病理变化较为严重。

图3 各组小鼠肝脏病理组织学观察（HE染色，20×）

2.2.4 脾脏 对照组G整体结构正常，脾小结结构清晰，无明显增大缩小，红髓白髓界限分明，无明显坏死，淋巴细胞无明显变性坏死，组织未见明显中性粒细胞浸润。试验组1A、7A、9A无明显特征性病变；2A、3A、8A少量中性粒细胞浸润；4A淤血；5A出血；6A红细胞浸润；10A红髓白髓界限不清；11A中性粒细胞浸润；12A结缔组织增生；13A淋巴细胞增生，红细胞浸润（图4）。结果表明，AH1701、AH1802、AH1803感染小鼠脾脏组织病理变化较为严重。

图4 各组小鼠脾脏病理组织学观察（HE染色，20×）

2.2.5 肾脏 对照组G整体结构正常，未见肾小管上皮细胞明显脱落水肿，肾小球结构清晰可见，组织未见明显炎症细胞浸润。试验组1A少量炎症细胞浸润；2A、4A肾小管上皮细胞空泡性变性；3A血管充血，炎症细胞浸润；5A肾小球轻微出血；6A轻微出血；7A肾小管上皮细胞空泡性变性；8A无明显病理变化；9A组织间隙少量出血；10A出血；11A血管充血；12A肾小管上皮细胞空泡性变性，炎症细胞浸润；13A大量炎症细胞浸润，组织间隙轻微出血（图5）。结果表明，AH1703、AH1802、AH1803、AH1804感染小鼠肾脏组织病理变化较为严重。

图5 各组小鼠肾脏病理组织学观察（HE染色，20×）

2.3 感染小鼠各组织脏器中PRV载量的检测结果

13株PRV安徽分离株在感染小鼠各组织脏器中的病毒载量因不同毒株、不同脏器存在差异。试验组第1～9、12～13组肝脏病毒含量显著低于第10、11组（P＜0.05），第10组显著低于第11组（P＜0.05），第11组病毒含量最高；第1～9、12～13组脾脏病毒含量显著低于第10、11组（P＜0.05），第11组显著低于第10组（P＜0.05），第10组病毒含量最高；第1～6、8、9、11～13组肺脏病毒含量显著低于第7、10组（P＜0.05），第7组显著低于第10组（P＜0.05），第10组病毒含量最高；第2、3、5、8、9、11、13组间肾脏组织病毒含量以及第4、6、10、12组间肾脏组织病毒含量无显著差异（P＞0.05），但均显著低于第7、1组（P＜0.05），第7组与第1组差异不显著（P＞0.05），第1组病毒含量最高；第1～7、9、12～13组脑组织病毒含量均显著低于第8、10、11组（P＜0.05），第8组显著低于第10组（P＜0.05），第10组显著低于第11组（P＜0.05），第11组病毒含量最高。结果表明，AH1802和AH1803感染小鼠肝脏、脾脏、脑中的病毒含量显著高于其他11株（P＜0.05），AH1703和AH1802在肺脏中的病毒含量显著高于其他11株（P＜0.05），AH1703、AH1704和AH1804在脑和肺脏中的病毒含量均显著高于肝脏、脾脏和肾脏（表2）。

表2 13株PRV分离株攻毒后小鼠各组织病毒载量的测定结果 ng/μL

3 讨论

PR具有传播快、病死率高、流行范围广、传播途径多、病原体顽固等特点。自2011年以来，我国多省免疫过PRV基因缺失疫苗（Bartha-k61株）的猪群均出现PR疫情，其主要表现为突发性大面积母猪流产，肥育猪致死性感染，猪群gE抗体阳性率突然升高。有研究表明，此PR的暴发是由PRV变异株引起[9]。新的PRV流行株在多个基因位点发生了抗原变异，变异株与经典株属于两个不同的进化分支，且Bartha-k61株疫苗不能对变异株的攻击提供完全抵抗[10-11]。2012年以来，安徽省部分地区也相继发生PR。李春芬等[7]对2013—2017年安徽部分地区22 130份血清样品进行PRV-gE抗体检测，结果显示猪群PRV感染呈现逐年上升趋势。袁献宇等[8]从2016—2018年安徽临诊病例中共分离鉴定了15株PRV，其主要毒力基因核苷酸序列均与2011年国内PRV变异株同源性较高，变异株已成为安徽省主要的流行毒株。面对PRV变异株的广泛流行，对PRV变异株进行致病性研究，了解流行毒株的特征，对于提出科学有效的防制措施具有重要意义。

因PRV感染猪、羊及小鼠组织病理学病变相似，且小鼠感染PRV强毒株后病理变化明显[11]，故本研究以小鼠为试验动物模型。PRV只有1个血清型，不同毒株在毒力和生物学特性等方面存在差异。本研究LD50测定结果显示，13株PRV的LD50在102.569～105.167TCID50之间，其中AH1802和AH1803的LD50分别为102.569TCID50和102.833TCID50，AH1603和AH1703的LD50均为105.167TCID50，表明PRV安徽分离株之间的毒力存在差异，AH1802和AH1803对小鼠的致病力最强，AH1603和AH1703对小鼠的致病力最弱。病理学结果显示，小鼠肝、脾、肺、肾脏和脑等部位均有不同程度的出血、肿大，但各组织的病变程度因不同毒株而异，其中AH1802、AH1803引起的病变较其他毒株严重，主要表现为病毒性脑炎、脑水肿，肺、肝脏出血、炎症细胞浸润，脾脏红白髓界限不清，大量炎症细胞浸润，肾脏出血等，进一步表明源自安徽不同地区的13株PRV毒力不同。

不同毒力PRV毒株感染后在机体内的分布存在差异，强毒株广泛分布于全身，而弱毒株和中等毒力毒株在体内的扩散只局限在中枢神经系统（central nervous system, CNS）[12]。本研究13株PRV经颈部皮下攻毒小鼠，试验组小鼠出现精神沉郁、食欲下降、呼吸加快等现象，部分小鼠出现奇痒、啃咬注射部位等典型PR症状后不久死亡；发病和死亡小鼠多个组织器官均出现明显病理变化，且从发病和死亡小鼠的脑部、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等组织均检测出PRV核酸，而对照组小鼠则均健活，且组织器官未呈现异常变化，表明13株PRV在发病和死亡小鼠体内分布广泛，对小鼠具有较强的致病性。

荧光定量PCR检测结果显示，13株PRV在感染小鼠各组织中的病毒载量因不同毒株、不同脏器而各有不同，其中AH1802和AH1803感染小鼠在脑、肝脏、脾脏中的病毒载量显著高于其他11株（P＜0.05），AH1703和AH1802在肺脏中的病毒载量显著高于其他11株（P＜0.05），AH1601在肾脏中的病毒载量最高，AH1703、AH1704和AH1804在脑和肺脏中的病毒载量显著高于肝脏、脾脏和肾脏，这或与毒株来源于不同地区、毒株本身发生变异和PRV在小鼠内的侵染途径不同有关，究其原因需要进一步地深入研究。

综上表明13株PRV均对小鼠具有较强的致病性，且AH1802和AH1803对小鼠的致病性强于其他毒株。针对PR的防控策略，在重视和加强疫苗免疫的基础上，加强毒株遗传变异研究，针对性地进行疫苗研发才是控制PR的关键。本研究不仅丰富了安徽PR流行病学资料，为进一步研究PRV安徽分离株的抗原性奠定基础，也为安徽地区PR的有效防控提供了科学依据。