MCN技术在毒性检测和环境监测中的应用研究

张茂荣，黄碧捷，涂志睿，廖 俊

(江汉大学 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430056)

1 引言

生态环境部于2019 年4 月首次发布《水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法》(HJ 1016-2019)，该标准2019 年9 月起正式实施，标志着经过近40 年在我国的研究与应用，蚕豆根尖微核检测技术(以下简称：MCN技术)终以国标的形式正式进入到环境监测中。1982 年，Degrassi等正式建立了MCN技术方法体系。随后，陈光荣、王英彦、金波等研究者做了大量的基础应用研究工作，促使我国于1986 年就将蚕豆根尖微核实验列入到《环境监测技术规范》生物监测(水环境)部分。2002 年，该技术又编入《水和废水监测分析方法》(第四版)，用于水与废水遗传毒性的规范检测[1]。EPA(美国环保署)也利用MCN技术对环境致癌物进行标准化试验，建立了毒性数据库并建议在全世界推广[2]。1980～2018年，CNKI中关于根尖微核研究的文献有1016篇[3]，2008年开始该领域的研究趋于平稳。随着HJ 1016-2019的正式实施，必然带来新一轮热点的MCN技术的相关研究与应用。

2 MCN技术原理与优势

微核是指位于细胞浆中独立于主核的小核[4]，是细胞受外界胁迫后由有丝分裂后期散失着丝粒的染色体片断产生，微核的发生频率与细胞染色体发生损伤、变异的频率显著相关。蚕豆细胞DNA含量多，染色体数目少且大，对外源诱变物敏感且易于观察[5]，是经典的遗传学研究材料。蚕豆根尖微核的突变形成主要来源于稳定性染色体畸变[6](易位、到位、缺失等)。以蚕豆微核的变化做为检测指标的MCN技术具备成本低、试验周期短、操作简便、结果可靠、灵敏度高等优点[7]。MCN技术的核心就是要建立待检物与受试物间良好、稳定和明确的效应-剂量关系。已有研究表明：辐射，声波，重金属，无机非金属，叠氮化物、苯环等有机污染物、抗菌素、真菌霉素等微生物因素都能诱发蚕豆根尖细胞形成微核，重复性好，已在环境监测领域有着广泛应用，例如用于水(淡水、海水、工业废水、地下水、核废水、自来水)污染监测，土壤污染监测，空气污染监测，毒物(农药、药品、矿尘、洗涤剂、香烟等)致突变性检测，食品安全等多方面。

世界上至今已发展了百余种方法检测污染物的遗传毒性。1975年建立并不断发展完善的可用于污染物致突变性的沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)已被广为采用。ISO(国际标准化组织)发布了《水质 水和污水的遗传毒性测定 沙门氏菌/微粒体试验》(ISO 16240-2005)并执行至今。我国也相继发布了《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》(GB 15193.4-1994、GB 15193.4-2003，均已废止)、《农药登记毒理学试验方法(第14部分：细菌回复突变试验)》(GB/T 15670.14-2017)等标准。Ames试验也能用于环境监测中的致突变性检测，相比于Ames试验，MCN技术的优势在于所需仪器和实验室条件简单，经济性强，对待检物要求低，不需要纯化处理，受限因素更少，操作要求不高。在以复合污染和未知痕量污染物为特征的现实各环境介质条件下，只需要判断其突变性，而不需要严格确定具体某污染物的突变性下限值。因此，MCN技术成为了我国环保部门颁布的环境监测领域采用的首个国标致突变性检测方法。笔者认为：Ames试验和MCN技术用于环境监测中致突变性检测并不冲突，分别从动物/微生物细胞和植物细胞两方面染色体的变化揭示了污染物的遗传毒性特征，起到相互补充和相互验证的作用。

3 MCN技术中致突变性的鉴别方法

MCN技术直接得到的实验数据是微核千分率(MCN ‰)。污染程度或致突变性的判断的是以实验中得到的不同的微核千分率数值为基础。《水环境生物检测技术规范：蚕豆根尖微核技术》采用MCN污染指数(PI)区间划分方法判断试样的污染程度。污染指数(PI=MCN试样/MCN空白)按不同的数值区间，如0～1.5、1.5～2、2～3.5以及3.5以上，分别对应基本无遗传性污染，轻度污染，中度污染以及重度污染。PI值大于1.5预示着该污染物具有了一定的遗传毒性。该传统方法判定致突变性是有偏差的，空白组、对照组和试样组中的蚕豆都可能随机产生数量相对较多的微核，仅用平均值的方式并没有考虑到随机因素，缺少统计学验收支撑，导致本身就是随机概率的致突变性的结论容易出现假阳性或假阴性。HJ 1016-2019并未采用传统的污染指数法，而是采用了MCN试样与实验室历史累积MCN空白相比较，再通过非参数检验法(推荐Kruskal-Wallis方法)计算判断两者间是否存在显著性差异相结合的判定方法。该方法既考量了微核千分率数值变化的直观体现，又考虑到了统计学意义上的显著性因素，使得结论更科学，更可信。

4 MCN技术的新应用

MCN技术应用广泛，用于重金属、有机物、药物的遗传毒性的研究被大量报道。随着MCN技术的不断成熟发展，无论是否已知待测物的成分及其配比，尤其是对痕量污染物的综合遗传毒性效应判断上，都可以利用MCN技术。近5年来，MCN技术在药物、日常生活用品、食品/添加剂、自然水体及特殊工业废水和场地污染监测等方面的应用上显示出独特的优势。

4.1 MCN在药物遗传毒性检测中的应用

MCN技术已被应用到检测强力霉素(DOX)、环丙沙星(CIP)、三氯卡班(TCC)、卡马西平(CBZ)、阿莫西林、四环素类抗生素(如：土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四环素(TTC))和磺胺类兽药(磺胺嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)和磺胺甲噁唑(SMZ))等药物遗传毒性上。以上药物都能诱发微核效应。例如：DOX、CIP、TCC和CBZ在12.5～100 mg/L浓度范围内，微核千分率均显著(P<0.05)高于对照组，PI值均大于3.5，属于重度损伤，微核千分率随浓度的增大均呈先增后减的趋势[8]。OTC、CTC和TTC在0.1～1.6 mmol/L浓度范围内，微核千分率均高于3.33‰，PI值均大于1.5，且差异显著，微核千分率随浓度的增大呈先减后增的趋势[9]。SD、SMM和SMZ在1～100 mg/L浓度范围内，微核千分率均在20 ‰左右，显著高于空白组(6.5‰)，微核千分率随浓度变化不明显[10]。随着新型药物的不断研发及使用，MCN在药物遗传毒性检测中的应用会越来越多，将为药物安全使用和药物进入环境后的生态风险研究提供支撑。

4.2 MCN在日常生活用品毒性检测中的应用

MCN技术在检测日常生活用品(尤其是个人护理品)领域应用很广。大量研究集中在对家用洗涤剂(衣物洗涤剂(洗衣粉、洗衣液等)、清洁用品(洗洁精、洁厕剂等)和日化用品(洗发水、洗面奶、沐浴露、精油等)，染发膏/剂(海娜粉)，洗甲水，蚊香液(氯氟醚菊酯)，塑料袋浸滤液，增塑剂(邻苯二甲酸二丁酯)等的检测中。例如：许媛媛[11]等研究发现3种不同染发膏分别在0.10、1.00、4.00 g/L处理浓度时的最高PI值分别为139.39、95.32、63.63，即使是稀释10倍后，PI值也大于3，有较强的遗传毒性风险。李莹[12]等将3种蚊香液制成25 %、50%和75%的体积浓度时，PI值均在2～5之间，75%体积浓度的蚊香液微核千分率为(2.5±0.65)‰显著高于空白组的(0.5±0.29)‰。不同的塑料袋浸滤液制备温度对诱导的微核千分率影响较大，其随温度的增加而增大。常温条件下，白色食品塑料袋和红色普通塑料袋浸提液微核千分率较小，随浸提温度升高，快递包装袋浸滤液产生较大的遗传损伤[13]。赖柯华[14]等发现0～0.2 mg/L的薰衣草精油诱导蚕豆根尖细胞的微核千分率和脂质过氧化呈正相关；超过0.2 mg/L时细胞正常的生理代谢和应激反应受到影响。对日常生活用品的MCN技术应用研究的报道均发现了灵敏的微核反应和相对应的剂量-效应关系，即使不完全清楚这些物品具体组分和含量，也能判断其遗传毒性，并且能运用到几乎全部的日常生活用品的检测中。

4.3 MCN在食品/添加剂检测中的应用

食品和食品添加剂安全问题是当前的热点研究问题之一。MCN技术能有效、快速的鉴别食品/添加剂的遗传毒性效应。普洱茶、泡面、苏丹红、香烟烟雾水、辣条、明矾(硫酸钾、硫酸铝)、食物水提取液(西芹、大蒜)等均有利用MCN技术检测的文献报道。普洱茶浓度小于5.0 g/mL时，微核效应不明显；大于8.0 g/mL时，微核数和PI值均显著增大，饮用低浓度的茶水更有益于身体健康[15]。香烟烟雾水溶液在0.5～8支/mL的浓度范围内，大蒜的微核千分率随着浓度的增加而极显著增加，PI值均大于3.5，能在0.5支/mL的低浓度和较少处理时间(12 h内)就对植物遗传物质产生严重损伤[16]。明矾在0.1～1.5 mg/mL浓度范围内，微核千分率随浓度呈先上升后下降的趋势，浓度为0.5 mg/mL时达到峰值[17]。0.1～1.0 g/mL西芹水提液对蚕豆微核千分率的产生没有诱导作用，西芹水提液具有抑制遗传毒性的作用，可作为抗突变保健品进一步开发利用[18]。

4.4 MCN在环境监测中的应用

5 应用MCN技术对武汉城区自然水体的监测

5.1 样品处理及实验方法

水样采集：分别在2020年11月(秋季)和2021年5月(春季)，对武汉市的三角湖(SJ)、龙阳湖(NY)、南太子湖(NTZ)、内沙湖(NS)、举水河(JS)、道观河(DG)、北湖(BH)、菱角湖(LJ)和汤逊湖(TX)采集水体样本，样本为混合样，每个样品测定3次、6个平行，取平均值。空白样品测定20次取平均值。

实验方法：按HJ 1016-2019在实验室中进行。记录各水样微核千分率(MCN试样)；计算其污染指数(PI=MCN试样/MCN空白)和显著性差异的统计量值(H值，Kruskal-Wallis法)，若 H≥3.84(显著性水平α=0.05)，反之则差异不显著。当MCN试样≤实验室历史累积MCN空白上限(参考值6.6‰)，则该试样不存在致突变性(-，阴性)；当MCN试样>MCN空白上限，且本次MCN试样较MCN空白显著增加/非显著增加，则该试样存在致突变性(+，阳性)/疑似存在致突变性(±，疑似阳性)。

5.2 实验结果

本次实验的空白值MCN空白为2.9‰；MCN空白上限取HJ 1016-2019中参考值6.6‰。将春、秋两季9个自然水体混合样监测和计算结果列于表1。结果显示：无论是春季还是秋季，选取的9个自然水样点均未发现其致突变性，水质状况良好。相比于空白，各水样均发生了微核反应，PI值范围是1.01～1.44之间，均划分为基本无遗传性污染。H值均显示与空白无显著性差异。南太子湖和内沙湖比较接近临界值，应引起关注。

表1 武汉市9个自然水体的MCN检测结果

6 结论与展望

通过应用MCN技术对武汉市自然水体采样、测试分析结果表明：所有的水体样本都发生了微核反应，PI值均小于1.5，未显示出遗传毒性和致突变性。蚕豆根尖微核检测技术已在污染物检测和环境监测应用领域展示着强大的生命力。随着HJ 1016-2019的发布与实施，该技术逐渐做到了规范化、标准化和系列化，是较好的鉴定遗传毒性的试验方法。然而，MCN技术依然只适用于测试潜在的染色体损伤因子，从植物细胞伤害推断到人群健康，必然还存在不确定性和局限性，需要在更微观的层次上揭示其毒性机理，在扩宽MCN技术应用的同时，对其超显微结构和致突变分子机制等领域值得深入研究。