丝素蛋白-羟基磷灰石三维大孔支架复合脂肪干细胞体外构建组织工程骨的可行性研究

丁晓明，张凯三，刘婷婷，朱明，王祥杰，潘月兴，刘玉田，郭振光，徐开民，杨彬

(1.日照市中医医院，山东 日照 276800；2.日照市人民医院，山东 日照 276827)

因肿瘤切除、创伤和骨髓炎等导致的骨损伤、骨缺损，处理较为困难。目前常用的自体或异体骨移植、骨搬移等技术均有一定的疗效，但都存在一定的缺陷[1-4]。骨组织工程技术的出现，给骨缺损修复带来了新的思路[3,5]。骨组织工程技术的关键在于支架的构建[6-8]，支架的孔径、孔隙、连通性对于所构建的组织工程骨的生物力学特征具有重要影响。丝素蛋白(silk fibroin，SF)是一种由18种氨基酸组成的天然大分子蛋白，结构稳定、性能优良、可塑性强[9]。羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是骨基质的主要矿物质成分，因其本身的生物活性和骨诱导作用[10]，可与聚己内酯、胶原和SF等天然或合成材料相结合制备骨支架[11-14]。本研究探讨了SF-HA三维大孔支架复合脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)体外构建组织工程骨的可行性，现总结报告如下。

1 材料与仪器

Ⅰ型胶原酶、CCK8、转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、纳米级HA(Sigma公司)，石蜡(上海永华石蜡有限公司)，兔ADSCs(湖南欣瑞生物科技有限公司)，成骨诱导液(成分包括10 ng·mL-1TGF-β1、100 ng·mL-1IGF-1、50 μg·mL-1抗坏血酸、40 μg·mL-1L-脯氨酸、6.25 μg·mL-1胰岛素、6.25 μg·mL-1转铁蛋白、6.25 ng·mL-1硒酸、100 μg·mL-1丙酮酸钠、300 μg·mL-1L-谷氨酰胺、10%FBS和1%青霉素-链霉素混合溶液)，兔Ⅰ型胶原Elisa试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)，链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，S-4800扫描电子显微镜(Hitachi公司)，Sky Scan 1174 micro-CT(Bruker公司)。

2 方 法

2.1SF-HA三维大孔支架构建及性能评估

2.1.1SF-HA三维大孔支架构建 采用石蜡微球沥滤技术[13]制备SF-HA三维大孔支架。将40～60目石蜡微球加入模具中，表面给予合适的压力压平，移入预热的烘箱中在50 ℃加热60 min后室温冷却。将提纯后的SF配制成10%溶液。称取一定量的纳米级HA粉末，按照质量比1∶10添加蒸馏水制成10%HA匀浆。2种液体按照1∶1混合，在超声振荡器中混匀后加到模具中，真空抽吸后移入-80 ℃冰箱4 h，在无水乙醇中浸泡2 h使SF结晶，以正己烷提取石蜡微球后剩余的即为支架结构。

2.1.2SF-HA三维大孔支架性能评估 取部分支架样本使用micro-CT进行扫描重建，使用Image J软件从扫描图片中选择50个以上孔隙，观察支架结构并计算支架结构的平均孔径和支架孔隙率，支架孔隙率=[1-(支架总体积-支架结构体积)/支架总体积]×100%；将支架样本放入PBS中浸泡24 h，置于MTF-100力学加载装置加力平台上，以0.5 mm·min-1进行压缩测试，计算支架的弹性模量，弹性模量=(截面的载荷/截面面积)/(支架压缩前后高度差值/支架原始高度)。

2.2SF-HA三维大孔支架生物相容性评估将兔ADSCs以成骨诱导液培养7 d后，按照1×107个·mL-1的密度接种到SF-HA三维大孔支架上，孵育2 h后添加成骨诱导液，移入培养箱继续培养，定期更换培养液，进行以下测试：①培养7 d后，取样浸入2.5%戊二醛固定，经梯度乙醇脱水，切片喷金后使用扫描电子显微镜观察；②分别于培养7 d、21 d后取样，使用多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，透明渗透后，石蜡包埋机常规包埋切片，后经脱蜡处理，进行HE染色后镜下观察；③分别于培养7 d、21 d后取样，以CCK8测定细胞增殖情况。

2.3ADSCs在SF-HA三维大孔支架上的成骨分化情况评估

2.3.1定性观察 分别于SF-HA三维大孔支架ADSCs复合体培养7 d、21 d后取样，使用多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，透明渗透后，石蜡包埋机常规包埋切片，经脱蜡处理，取切片分别进行Von Kossa染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色。

Von Kossa染色步骤如下：①切片脱蜡、复水；②PBS洗涤1遍；③5%硝酸银水溶液浸泡后紫外光照射10 min；④蒸馏水洗涤5 min；⑤5%次亚硫酸钠溶液中放置2 min；⑥蒸馏水洗涤5 min；⑦衬染1 min，水洗后镜检。

Ⅰ型胶原免疫组化染色步骤如下：①切片脱蜡、复水，室温下滴加3% H2O2灭活内源性酶，蒸馏水冲洗3次，每次2 min；②加入5%BSA，在20～37 ℃封闭30 min；③滴加鼠抗兔Ⅰ、Ⅱ型胶原抗体，冰箱4 ℃过夜，PBS缓冲液漂洗、晾干；④滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育2 h，PBS缓冲液漂洗、晾干；⑤滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS缓冲液漂洗、晾干；⑥DAB室温显色5～15 min(镜下观察颜色变化确定显色时间)，蒸馏水洗涤；⑦再经苏木素轻度复染 3 min，蒸馏水洗涤，水洗后镜检。

2.3.2定量评价 分别于SF-HA三维大孔支架ADSCs复合体培养1 d、7 d、21 d后取样，以Elisa测定其中Ⅰ型胶原含量。具体操作步骤如下：每个时间取5个样本，浸入PBS小心清洗、剪碎，再经粉碎处理后，反复冻融得到匀浆，离心后提取上清液；取100 μL上清液，按照Elisa试剂盒说明书操作，使用酶标仪测定波长450 nm处的OD值，根据标准品曲线范围(0～100 ng·mL-1)推算出对应每组样品浓度。

2.4 数据统计采用SPSS20.0统计软件进行数据统计分析。SF-HA三维大孔支架ADSCs复合体培养7 d、21 d时的细胞数量比较采用t检验；SF-HA三维大孔支架ADSCs复合体培养1 d、7 d、21 d时的Ⅰ型胶原含量比较采用方差分析，不同时间点之间的两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1SF-HA三维大孔支架性能评估结果支架内部可见均匀排列的大孔结构，连通性好(图1)。支架孔径(365.30±27.10)μm，孔隙率(85.30±1.80)%，弹性模量为(54.93±5.44)kPa。

图1 丝素蛋白-羟基磷灰石三维大孔支架Micro-CT三维重建图像

3.2SF-HA三维大孔支架生物相容性评估结果扫描电子显微镜图像显示细胞能够很好地在支架孔壁上黏附和伸展，细胞通过孔隙之间的连通结构长入孔隙内或在孔隙边缘呈拉网样覆盖，细胞周围可见基质分泌(图2)。HE染色结果显示，细胞核深染、胞浆红染，均匀黏附在支架孔隙内壁上，随成骨诱导培养时间延长，细胞和基质明显增多(图3)。CCK8检测结果显示，培养21 d时SF-HA三维大孔支架上的细胞数量较培养7 d时增加(1.14±0.08，1.98±0.11，t=13.810，P=0.000)。

图2 丝素蛋白-羟基磷灰石三维大孔支架脂肪干细胞复合体成骨诱导培养7 d后扫描电镜图像

图3 丝素蛋白-羟基磷灰石三维大孔支架脂肪干细胞复合体HE染色结果(×200)

3.3ADSCs在SF-HA三维大孔支架上的成骨分化情况评估结果Von Kossa染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色可观察到钙沉积和Ⅰ型胶原积累，而且随时间延长不断增多(图4、图5)。成骨诱导培养1 d、7 d、21 d时，SF-HA三维大孔支架ADSCs复合体上Ⅰ型胶原含量比较，差异有统计学意义(0.90±0.24，1.26±0.27，3.89±0.82，F=49.780，P=0.000)；成骨诱导培养21 d时的Ⅰ型胶原含量高于成骨诱导培养1 d、7 d时(P=0.000；P=0.000)；成骨诱导培养1 d、7 d时的Ⅰ型胶原含量比较，差异无统计学意义(P=0.059)。

图4 丝素蛋白-羟基磷灰石三维大孔支架脂肪干细胞复合体Von Kossa染色结果(×200)

图5 丝素蛋白-羟基磷灰石三维大孔支架脂肪干细胞复合体I型胶原免疫组化染色结果(×200)

4 讨 论

骨组织工程技术经过多年的发展，已取得了很大的进步[2-3,6]。在众多骨支架材料中，SF的细胞附着率和增殖率较好，并且具有合适的力学性能、较低的免疫原性以及可控的降解速率等特征，是制备骨支架的理想材料[8,12]。HA也具有较好的生物活性和骨诱导作用，可以与天然或合成材料共同制备理想的骨支架[13-17]。

骨支架制备技术较多，如冷冻干燥、盐沥滤、石蜡微球沥滤等[8,13,18-20]。石蜡微球沥滤技术可操作性强，通过控制石蜡微球体积及加热温度、时间，可制作出具有理想孔隙和连通性的骨支架。但目前采用该方法加工SF支架的研究较少。基于以往的研究，我们模仿天然骨的结构，通过石蜡微球沥滤技术成功制备SF-HA多孔结构作为骨支架，并确定了10%SF和10%HA等比例混合的最佳比例，最终制备的骨支架具有良好的三维大孔结构，孔隙均匀、连通性好、力学性能优良，符合成骨细胞生长对于孔径、孔隙率的基本要求[13]。

支架材料本身的骨诱导作用并不能完全满足细胞在支架上的成骨诱导分化，这就需要生长因子的调节功能。使用特定的生长因子能够引导和加速细胞在特定方向上的生长、分化[21-23]。生长因子的添加需要经过多重检测，充分评估其对细胞生长和诱导分化的利弊，选择相对合适的浓度。根据以往关于ADSCs向骨细胞诱导分化的相关研究[24-26]，我们最终选择本研究所述的成骨诱导液成分进行ADSCs成骨诱导。

从观察结果可以看出，ADSCs在骨支架上经过诱导培养后，通过连通结构长入孔隙内或在孔隙边缘呈拉网样覆盖，细胞周围可见基质分泌，支架上的细胞随培养时间延长不断增多，表明细胞在支架结构内黏附、增殖良好；Von Kossa染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色、Elisa检测结果显示，支架上的骨基质(钙和Ⅰ型胶原)随诱导培养时间延长不断增加。

本研究的结果显示，SF-HA三维大孔支架复合成骨诱导培养的ADSCs具有在体外构建组织工程骨的可能。接种在SF-HA三维大孔支架上的ADSCs最终能否分化为成骨细胞及SF-HA三维大孔支架复合ADSCs能否再生骨组织，还有待于进一步的研究来证实。