岩石壁上爬山虎茎产生不定根时木质部中激素与结构变化研究

赵 爽，王 欢，卜晓英，董爱文

（吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，湖南张家界 427000）

0 引言

爬山虎(Parthenocissus tricuspidataPlanch)系葡萄科(Vitaceae)爬山虎属(Parthenocissus)多年生大型落叶木质藤本植物，耐贫瘠，耐旱，生长速度快，茎叶覆盖率高，对大气中SO2、Cl2、F2、Pb、Cr、Cd以及土壤中重金属离子有较强抗性和富集作用[1-2]，不仅可用于绿化、美化，也可遮阴、增氧、降温、增湿、滞尘、杀菌、减弱噪声和保护建筑物等功效[3-5]，是藤本类植物中用得最多的绿化材料之一，也是目前最理想、应用最多的城市垂直绿化植物品种[6]。其一年生茎上各型吸盘紧贴墙壁，带来的观赏性价值非常之高，植物新长出的叶子多数是偏绿的，然而秋天该植物叶子逐渐变成砖红色，金黄色或亮橙色，成为城市一道靓丽的风景线[7-8]。

不定根发生的研究是发育生物学的重要领域，但其自发生根与诱导生根在生理上存在较大差异，而木本植物茎生根的研究——以插条、组织培养和空中压条形成愈伤组织生根为研究手段。而插穗经不同激素处理生根[9-10]与不同条件下插穗生根等研究方法[11-12]；以及利用LED调制光质促进不定根生成[13-14]；还有利用加温解除插穗休眠促进生根[15]及基因在插条不定根发育中的作用[16]；组织培养具有遗传稳定性高、繁殖速度快等优点，因此也是实现木本植物无性繁殖的主要方式[17-18]；此外空中压条也是实现木本植物无性繁殖的有效方法[19-21]。而爬山虎生根方面：依据根冠平衡理论采取高空压条促进其木质藤本茎上产生不定根，以此打破其茎的生长高度限制的研究[22]。组培方面有利用爬山虎引进的种子无菌苗对爬山虎组织培养中存在问题的研究[23]。此外，还有利用爬山虎半木质化嫩枝在浓度为10-7左右的NAA中处理，扦插成活率比较高[24]，以及用植物生长素与激动素对爬山虎嫩枝扦插生根的影响[25]和采用不同植物催根剂、不同浓度、不同基质配方和扦插方法研究‘花叶’爬山虎扦插繁殖[26]等的研究。这些主要是研究诱导木质茎生根的机制，然而，自发生根和诱导生根的植物或组织在不定根发生过程中存在较大的生理差异，有关自发诱导生根机理方面报道极少，木本植物茎在自然生长时自发产生不定根的机理研究还未见报道。因此本研究检测分析城市垂直绿化常用的爬山虎在岩石壁上自然生长时，其木质藤本茎上自发产生不定根时根原基发生及木质部中4种内源激素的动态变化，来探索它们在自发产生不定根时的作用，为依据根冠平衡理论，打破其攀援茎生长高度限制，更好应用于城市垂直绿化及矿山高陡岩质边坡的生态修复提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理步骤

选择吉首大学张家界校区内3～5 m高的岩石护墙上自然生长的爬山虎作为实验材料，于2019年4月开始萌芽生长的不同生长龄目标植株作出标记并进行记录。分别于2019年6月8日、7月8日和8月8日携液氮采样，其中7月8日所采样品速冻处理后送上海酶联生物科技有限公司检测；6月中旬开始确定一年生未生根爬山虎茎后标记并外施激素以及形态解剖观测茎内细胞生长发育的变化，于8月8日携液氮采样茎木薄壁细胞已反分化的一年生爬山虎茎并测定其木质部中4种激素的含量。

1.2 试验方法

采集自然生长爬山虎茎后去掉枝叶并剪成长20 cm的切段并标记后放入液氮中，回实验室后在-40℃的超低温冰柜中保存24 h，用干冰包埋后12 h内送达上海酶联生物科技有限公司检测。在超低温冰柜中撕去表皮等只留下木质部，取每切段中间10 cm左右约5.0 g的试材，在冷冻混合球磨仪(Retsch MM400)内研磨，每个处理重复3次，收集到50 mL离心管内，再加入约40 mL冷甲醇置于4℃条件下浸提7 h以上，4℃、8000 r/min、10 min离心后，过滤，收集到50 mL小烧杯冷冻浓缩至1/3左右，用0.5 mol/L Na2HPO4调至pH 8.0，石油醚萃取（至少3次）以去除酚类等物质，取水相加入0.1gPVPP（聚乙烯吡咯烷酮），160r/min35min摇床震荡后过滤，用2 mol/L柠檬酸调至pH 3.0，乙酸乙酯萃取3次，取酯相于冷冻干燥机(SCIENTZ-10ND)中干燥至粉末，加入pH 3.0的磷酸盐溶液溶解，C18固相萃取小柱纯化待测样品，冷冻干燥至粉末，按照试剂盒要求用冷色谱纯甲醇配制待测样品溶液。

外施植物激素的爬山虎一年生茎的形态解剖观测：按卜晓英等[27]的方法进行冷冻切片并制作荧光显微切片，制好切片后用带365 nm的μ激发光滤色片及相应吸收滤色片的BHS-312荧光显微镜(OLYMPUS)观察并拍片。

1.3 数据处理

利用Excel软件计算爬山虎茎木质部内激素的OD均值标准差与均值。利用IBM SPSS Statistics 19软件对爬山虎茎内激素OD值进行方差分析(ANOVE)，差异显著性运用Duncan's检验进行多重比较分析。利用Origin Pro 8对回归方程计算出的浓度数据处理并用Excel软件作图。

2 结果分析

2.1 外施激素茎的解剖结构

一年生未生根爬山虎的茎在外施激素后，其维管束间薄壁细胞反分化前状态、不定根原基的形成、生长发育以及不定根突破皮层与表皮，见解剖图1、2与3，从荧光显微图1中可以看出外施激素后7～10天左右的时间，茎维管束间不同位置的薄壁细胞（图1、2）出现明显的内源物质变化；而从维管束间薄壁细胞反分化到不定根原基形成（图2）大约需要10～15天的时间；不定根原基形成后其生长发育突破皮层与表皮大约需要5～15天的时间（图3）。因此，选择在外施激素后20天左右的一年生茎作为检测试材。从图1与图2可以看出爬山虎一年生茎产生不定根起源于茎的维管束间，因此属于内起源，而图4、5及多年生茎上不定根的产生是否也是内起源有待进一步研究。

图1 一年生爬山虎茎束间木薄壁细胞的萌动(×100)

图2 一年生爬山虎茎中不定根原基形成与发育(×100)

图3 一年生爬山虎茎中不定根生长发育突破皮层与表皮(×100)

2.2 酶联公司检测结果

7月8日送上海酶联生物科技有限公司检测的样品（图4～6为部分采样品），其ELISA检测OD值见表1。表中：样品1为3年生全茎生根的爬山虎茎；样品2为3年生未生根的爬山虎茎；样品3为5年生未生根的爬山虎茎；样品4为3年生节上生根的爬山虎茎；样品5为5年生全茎生根的爬山虎茎；样品6为一年生节上生根的爬山虎茎；样品7为一年生未生根的爬山虎茎；样品8为5年生节上生根的爬山虎茎；样品9为一年生未生根外施激素后生根的爬山虎茎，其ELISA检测OD值为8月8日自测值。数据利用Excel软件计算其均值和标准差，结果见表1。

表1 酶联生物科技有限公司检测结果

图4 五年生全茎生根的爬山虎

图5 三年生节上生根与逐步全茎生根的爬山虎

图6 一年生节上生根的爬山虎

表中OD值显示4种内源激素均在全茎生根的爬山虎茎木质部内的含量高于节上生根的爬山虎茎木质部内的含量高于未生根的爬山虎茎木质部内的含量，这是否说明爬山虎自然生长时其茎上自发产生不定根需要多种内源激素协同作用有待进一步研究。

2.3 爬山虎生长茎自发产生不定根时茎内4种内源激素的浓度

根据6月8日、7月8日与8月8日检测的OD值（平行三）以及各次建立的回归方程计算出对应的激素浓度，利用Origin Pro 8对浓度数据处理并利用Excel软件作图，见图7～10（图中样品1是一年生节上生根的爬山虎茎、样品2是一年生未生根的爬山虎茎、样品3是一年生未生根的爬山虎茎外施激素后生根的茎、样品4是3年生全茎生根的爬山虎茎、样品5是3年生节上生根的爬山虎茎、样品6是3年生未生根的爬山虎茎、样品7是5年生全茎生根的爬山虎茎、样品8是5年生节上生根的爬山虎茎、样品9是5年生未生根的爬山虎茎）。

图7显示各试材木质部中IAA的浓度均很高，以鲜重计最高的为3年生全茎生根茎木质部中达11.486 μg/g，最低的为一年生未生根茎为 6.255 μg/g，但不生根一年生茎在外施激素后自发产生不定根时木质部内IAA的浓度增长至10.935 μg/g，远高于木本植物茎内0.001～1.000 μg/g的值；并有随不定根的产生、生长、突破皮层与表皮时IAA含量呈现先升后降的趋势；同时全茎生根茎木质部内IAA浓度＞节上生根茎木质部内IAA浓度＞未生根茎木质部内IAA浓度。

图7 爬山虎不同生长状态茎中IAA的平均含量

图8显示各试材木质部中CTK的浓度以鲜重计最高的是一年生不生根茎（CTK为150.235 ng/g）在外施激素后自发产生不定根时的232.295 ng/g，最低的为5年生不产生根的茎木质部内的137.930 ng/g；茎内CTK浓度有随不定根的产生、生长、突破皮层与表皮过程呈下降的趋势；同时全茎生根的茎木质部内CTK的浓度＞节上生根茎内CTK浓度＞未生根茎内CTK浓度。

图8 爬山虎不同生长状态茎中CTK的平均含量

图9显示各试材木质部中JA的浓度远低于植物营养器官按鲜重计10～100 ng/g的范围，但各生根茎的木质部内的浓度远高于不生根茎木质部内的浓度。

图9 爬山虎不同生长状态茎中JA的平均含量

图10显示各试材木质部内Me-JA的浓度极微，但各生根茎的木质部内的浓度远高于不生根茎木质部内的浓度。从图7～10中还可发现一年生未产生不定根的茎在外施激素后木薄壁细胞反分化形成不定根原基及其发育生长突破皮层与表皮时，茎木质部内4种激素的浓度均出现大幅增长，说明爬山虎自然生长茎自发产生不定根时需要多种激素的协同作用。

图10 爬山虎不同生长状态茎中Me-JA的平均含量

3 讨论

不定根发生研究是发育生物学的重要领域，自发性生根和诱导性生根的植物或组织在不定根发生过程中存在较大的生理差异，木本植物茎生根主要以插条、组培和空中压条过程形成愈伤组织的生根，插穗经不同激素处理[9-10]与不同条件下插穗生根等研究方法[11-12]以及基因调控[28]的愈伤组织生根是木本植物茎上生根研究的热点，这些研究主要是集中在诱导生根的机制方面，然而，有关自发诱导生根机理方面报道太少。已有爬山虎木质藤本茎生根研究的报道也是以空中压条[22]、组培[23]和插条[24-25]过程形成愈伤组织的生根，以及采用不同植物催根剂、不同浓度、不同基质配方和扦插方法研究‘花叶’爬山虎扦插繁殖[26]等的研究。而对爬山虎多年生未离体未破茎的生长茎上不定根自发产生的机制方面还未见报道。因此本研究开展爬山虎生长于岩石壁上的木质藤本茎内薄壁细胞自动反分化致其木质藤本茎内不定根原基自然发生及其相关研究，将丰富木本植物茎上生根的基础理论。

本研究通过解剖爬山虎一年生未产生不定根的木质茎外施激素后产生不定根原基时的结构，获得其起源于维管束间薄壁细胞的反分化（图1～2），并检测了全茎生根茎、节上生根茎与不生根茎木质部中4种内源激素的浓度，结果表明自发产生不定根的茎木质部内4种内源激素浓度均明显高于不生根的茎，且一年生不产生不定根的木质茎外施激素后产生不定根原基时木质部中4种内源激素也大幅升高。但对引发维管束间薄壁细胞自动反分化时4种内源激素的阈值还未能分析检测，未来研究引发爬山虎自然生长于岩石壁上的木质藤本茎木质部中内源激素升高的分子机制，将是厘清爬山虎自然生长茎自发产生不定根的有效方法，也为探索木本植物茎上自发产生不定根这一科学问题提供新思路。

4 结论

本研究以自然生长于岩石壁上的爬山虎木质藤本茎自发产生不定根为研究目标，观察到一年生爬山虎自然生长不生根茎外施激素处理后其维管束间薄壁细胞反分化产生不定根原基（图1～2），因此属于内起源。所检测的4种内源激素在自发生根的茎木质部内的浓度均明显高于不生根的茎（图7～10），且其IAA/CTK比值达到了27～76。对不产生不定根的一年生爬山虎茎进行外施激素处理使其产生不定根，此时茎木质部内4种激素的浓度均有大幅增高，因此爬山虎自然生长的木质茎自发产生不定根是在多种内源激素协同作用下而产生的。提示依据根冠平衡理论，可通过技术手段促进爬山虎生长茎上根系生长，来打破其攀援茎的生长高度限制，可更好的应用于城市垂直绿化以及矿山高陡岩质边坡的生态修复。