玉米预防转基因漂移试纸条快速检测方法

崔贵梅，李小波，马 樾，郝曜山，张欢欢，孙 毅

（1山西大丰种业有限公司，太原 030031；2山西农业大学生命科学学院，太原 030031）

0 引言

转基因玉米商业化在中国尚未开放，只允许在批准的范围内和可控条件下开展转基因玉米试验研究。随着国际和国内转基因玉米研究的快速发展，国内非法种植转基因玉米的现象层出不穷[1]，国内农业行政执法部门对农作物转基因实施监管的力度也在加大。加强农作物转基因检测和执法力度，防止转基因漂移对于保护中国生物技术育种的健康发展、生物多样性和农业生态安全都是至关重要的。

由于玉米属于高异交受粉作物，花粉的扩散距离受玉米扬花期的气象和地理条件影响，不同地方研究得出的结果差别较大[2-6]，借助风力及大气湍流玉米花粉传播距离可达800～1000 m以上[7-8]，常规玉米被非预期转基因漂移影响的可能性较大。欧洲2001—2010年期间在包括德国、瑞士和比利时在内的多个欧洲国家的216个地点进行的一系列大规模试验调查发现[9]，花粉来源最远的距离为4.45 km。在该研究中他们建议，在德国勃兰登堡州将Bt转基因玉米种植的缓冲带从100 m（2007年）扩大到800～1000 m。在中国，目前农业转基因生物安全监管制度规定转基因玉米隔离距离为300 m[10]。此外，异地材料资源共享，在常规玉米选育工作者之间交流频率也较高，未知因素造成转基因种子非预期扩散的可能性时有发生。因此，对非预期转基因漂移的检测十分重要。除了各地农业农村局科教处等专职检查部门抽查检测外，育种者自查自检是预防此问题发生的主要途径。

海南省南部的三亚、乐东、陵水三市县及周边地区，已经成为中国重要的育种基地。鉴于南繁的特殊性，这一地区在冬季育种单位集中，转基因漂移潜在风险高于全国其他地区，因而转基因生物安全在南繁地区备受关注[11-12]。使用转基因蛋白免疫层析快速检测试纸条，是目前最简便又行之有效的方法。按照适当的采样步骤，试纸条可以在给定的一批样品中以99%的置信水平检测出少于0.15%的转基因成分[13]。本研究从常规玉米育种者自查角度，根据多年实践经验，总结玉米转基因快速检测试纸条使用的具体方法和操作步骤，希望能为广大玉米育种工作者提供参考。

1 材料和方法

1.1 检测试验用品

购买转基因快速检测试纸条，分为检测多种基因类型的试纸条，国内目前常用的主要有3种（如图1-A）：分别是检测转抗虫基因BtCryⅠAb/Ac、检测转抗除草剂草甘膦Cp4 EPSPS基因和检测抗除草剂草铵膦Bar基因的PAT试纸条，市场上销售的多种类型的单价、二价和三价检测试纸条均为这3种基因表达蛋白的组合，这里不做赘述。

塑料EP试管，用于将检测样品放在里面研碎，根据样品量可选1.5 mL、2 mL或5 mL的，都是一次性使用耗材；塑料研磨棒，可清洗干净后重复使用，也可用一次性筷子尖头代替；纯净水；1支吸水用的大滴管及多支1次性使用的小滴管；放EP管的专用塑料孔板或自制泡沫孔板等。

1.2 检测样品取样

1.2.1 检测时期选择 检测玉米株系是否有转基因漂移，必须在玉米开花散粉前彻底排查完成，否则造成更大范围漂移就要被依法追究责任并受到处分。检测最佳时期是玉米幼苗期，一般在定苗后5～7片可见叶时即可以开始自查检测。当然也可以在播种前进行种子抽样检测，但干种子不容易捣碎研磨，检测量和灵敏度都不如幼苗期，因此检测玉米种子多适用于检疫部门和预期目标性较强的材料，而不太适合于转基因漂移检测。玉米植株生长到开花前期时，叶片较老也不如幼苗期的嫩叶好操作。

1.2.2 取样方法 取玉米幼苗任意一片叶的前端2～5 cm长，研磨用很小量叶片就够，不需要伤害太多叶片。

育种者自检，根据自己的材料有重点的取样：（1）新引进系列资源是稳定纯合自交系，但不明确是否其中有转基因材料，每份材料取一株，20～50份都可以先混合在一起进行初筛，确定没有即可放心；（2）以上是最理想的状态，但实际稳定自交系材料中也可能存在转基因的杂合体（外源单基因Aa），本世代分离有aa单株，所以只取1株是有风险的，建议每份材料随机取3～5株进行检测才更放心；（3）检测对象是来源不可靠的杂交基础群体，建议增加取样数量，直至抽检一半或全检。

取好的叶片用记号笔标记编号，能与地里取样株一一对应，分组样叶可叠放在一起，置于塑料自封袋里保鲜（如图1-B），取好的样叶也可在室温下或冰箱冷藏保存几天再检测。

1.3 试纸检测方法

1.3.1 操作试验步骤 将样品叶片按编号顺序分成若干组，一组的叶片叠在一起用剪刀剪齐一端，再剪下2 mm宽的细条形叶放入EP试管中，用研棒充分研碎，加入适量纯净水，再用研棒挤压搅匀，保证使每片叶条的汁液都溶于水中；取出研棒，将试纸条插入绿色溶液中，溶液会迅速从试纸条底端向上虹吸，稍等片刻，就可以看到试纸条上的显色条带出现。试纸条从上往下的第一条显色带表示该试纸条的有效性，如果未显色，说明试纸条已失效，需要重新更换试纸条（如图1-C）；第二条显色带表示是否存在外源基因蛋白，该条带显色阳性（+）表示被检样品中有外源基因蛋白，如果第一条显色而此条带不显色，则说明操作处理过程正常有效，而该样品中不存在目标基因蛋白。

1.3.2 操作经验和注意事项

（1）建议每组20片叶合并在一个EP管中研磨初检，熟练者可每组检测达50片叶，但需要将叶条逐渐放入EP管中，以保证全部叶都被研碎。

（2）沾有叶片汁液的剪刀和塑料研棒，每次用完都要注意清洗干净再用；如果使用木质筷子头研磨，须将叶绿素完全洗干净或削头后再用于研磨下一样品。

（3）试纸底端都标有浸入液面最深界线（如图1-C试纸条底端的MAX线），不能超过太多，否则影响附着于试纸条上药物试剂和抗体的作用。试纸条工作原理是利用能和外源基因表达蛋白特异结合的抗体与显色剂结合后被固定在试纸条内[14]，叶片研磨液中的转基因蛋白必须先与特异抗体结合，再虹吸上行与显色剂反应方能显示出条带颜色。所以不能逆向吸水或间断性虹吸，否则都会造成检测失败。

（4）如果一管内因为放入检测样叶太多，叶绿素浓度过大，往往会影响试纸条的虹吸作用，此时即使使用其他办法将液体沾滴上来或加水稀释也作用不大，会造成试纸条作废。因此在插入试纸条之前必须稀释好样液，EP管容量不够可更换新管进行稀释操作。建议采取少量叶片分开研磨加水，再用一次性小滴管吸取适量合并后再插入试纸条检测。

1.4 检测案例

以检测30份玉米材料为例，在田间每份材料随机取5株的叶片，共取150片样叶，用记号笔将材料的田间编号直接标记在叶片上，被取植株也要同样标记上编号（此为单株取样较麻烦）；也可以采取单行取样，然后将行内间植株样本合并，简略编号写在取样袋上，分组装在自封袋里带回，按上述方法检测。

2 结果与分析

2.1 检测案例结果分析之一

因为是预防性转基因漂移检测，多数情况下会是全阴性结果，证明转基因漂移的几率较小。为降低试验成本节省试纸条用量，本案例分析中采取50片叶混样检测的方法。首先将150片叶分成3组，为操作方便，每组研磨时先将叶片分装在2管中（每组25片叶），稀释溶液后再合并成1管，同时插入2种最常见的、可能被漂移的基因类型快速检测试纸条BT和CP4，观察到3组6个试纸条都显示出条带后，再用小吸管从3管中各取少量合并成1管，最后检测PAT试纸条。结果显示，7个试纸条都是阴性的，证明该30份材料安全，没有发生转基因漂移（如图1-D）。

图1 预防玉米转基因漂移快速试纸条法检测方法

2.2 检测案例结果分析之二

以上案例最后结果，在三组之一的样本中（EP管中包含10份材料50片样叶）发现BT试纸条呈阳性反应，其余试纸条都是阴性的。取出该样本稀释合并前2管研磨液，分别加水稀释溶液后再插入BT试纸条，找到其中1管为阳性的5个样品（25片样叶）的编号，重新取叶片研磨检测。将样本分成2组（3份材料15片样叶和2份材料10片样叶）检测，依此类推通过排除法，找到最后1份材料5片样叶，追溯漂移材料编号，如有必要可追溯到阳性单株。试验过程和结果如图2表示。

图2 试纸条法检测田间转基因漂移株系典型案例分析流程图

此操作流程从10份玉米材料中检测到1份转单抗基因（BT抗虫蛋白）漂移，不记检测到单株所耗试纸条数量，共使用9个试纸条，是该1/2排除法检测耗费试纸条最大用量，最小用量是7个。

其他排除法组合设计也可以采用，原则是样品全部被检测确认，并尽可能节约试纸条。

最后5个单株检测，因为估计阳性率高，采用分组法反而用试纸条数更多。采用逐株检测，结果4阳1阴，证明该株系是杂合状态(Aa)的转基因材料；如果5株都是阳性，则证明该系已经是稳定的纯合系(AA)转基因材料；如果仅1株检到阳性其余都是阴性的，证明可能是外源花粉或种子混杂造成的转基因漂移。

实际检测中，还会遇到其他多种情况，需要育种者对自己的材料来源比较了解，取样检测就更有目标性。这里只介绍2种典型情况以作示范。

3 讨论与结论

玉米预防转基因漂移检测是广大常规育种人迫切需求的。选育一个好的玉米品种，从组建基础群体材料开始到参加区试，至少需要5～8年，如果在选系前不慎被非预期的一粒花粉杂交造成转基因漂移，在不知情的状况下辛苦选育多代后，参加区试转基因检测呈阳性，辛苦几年的材料便失去了价值。玉米花粉量多且轻，转基因玉米花粉传播是转基因在空间逃逸的主要途径[15-16]。中国已于2020年6月开始陆续为一些转基因作物（包括棉花、玉米和大豆）颁发了安全证书，预计在不远的将来，将会有更多的转基因作物品种在一定范围内被批准进行商业化种植。因而这种预防性检测技术将会有更加广泛的应用。

有关转基因快速试纸条的灵敏性，笔者根据个人实践经验，最高可达1/50的阳性检出结果，但此时显色带颜色较淡，显色时间也需要较长。在检测案例结果分析之一中，最后使用的PAT试纸条实际大约是1/30的灵敏度，并不是1/150，因为取样每份是5片叶，即试验已包括重复数，结果更可靠。但如果采取此方案检测的是杂交群体，或每份被检材料只取1株样叶的情况，则无法保证检测的准确性。

目前，每种类试纸条只能检测一种类型的外源基因，而其他转基因类型是很多的[17-19]，并没有相对应的试纸条研发生产出来。因此采用快速试纸条法检测是否存在转基因漂移的漏洞很大，仅仅起到玉米育种者的自我筛查初检作用，真正鉴别是否有转基因还是需要专业检疫部门的DNA分子检测等技术[20-21]才能准确鉴定。

本研究是根据笔者10余年来开展转基因材料选育的经验总结而来，具有很强的实用性。本方法的操作步骤简便易学，非常适合专业和非专业育种者或检测人员对田间材料在自查或检验中使用。熟练掌握这一试纸条快速检测法，能有效筛查和预防由于花粉或种子非预期混杂造成的转基因漂移。本方法或经略微改良的类似方法，也可用于在其他植物中检测由花粉或种子非预期混杂造成的转基因漂移。