花椒几丁质酶基因ZaCHIT1的原核表达及纯化

杨德奕， 毛俊文， 赵德刚， 赵懿琛，

(1.贵州大学茶学院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/贵州省农业生物工程重点实验室， 贵阳 550025；2.贵州大学生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/贵州省农业生物工程重点实验室， 贵阳 550025;3.贵州省农业生物工程重点实验室， 贵阳 550025)

花椒(ZanthoxylumpiperitumDC.)别名山椒，属芸香科花椒属植物，常见为灌木或落叶小乔木[1]。花椒具有多种药理活性，并有显著的抗真菌作用和抗细菌作用[2]。植物的几丁质酶是一种病程相关蛋白，在植物生长和发育过程中发挥作用，如在授粉、衰老、萌发和体细胞胚胎发生过程[3-4]。可以将真菌的细胞壁的成分几丁质为底物水解成寡聚糖，在植物对抗真菌病害中起重要作用，因而广泛应用于植物抗病基因工程[5]。杨晋明等[6]使用农杆菌介导法把水稻几丁质酶基因导入甜瓜品种“雪脆蜜2号”，进行了田间抗病的生物学鉴定，结果发现，转基因植株提高了“雪脆蜜2号”对白粉病的抗性；罗晶晶等[7]接种白粉菌后在几个不同的时间点对黄瓜抗病品种JIN 5-508的表型进行观察，并且取样以测定几丁质酶基因的表达量升高或降低，结果表明，接种白粉菌后JIN 5-508黄瓜的几丁质酶基因表达量有了明显上升，尤其在接种白粉菌后的24 h时，抗病JIN 5-508黄瓜出现明显的乳突反应，以此来阻止白粉菌的入侵，说明在JIN 5-508黄瓜防御白粉菌侵染过程中几丁质酶基因起到了正向调控作用。本实验组前期已证实几丁质酶存在于花椒的各部位(如茎、果实、叶等)以及对各部位表达量的高低进行了研究[8]，但对花椒几丁质酶的原核表达以及纯化并没有进行深入研究。

原核表达是指选取希望进一步在体外表达大量蛋白质的植物、动物、微生物等目的基因与合适载体连接后导入大肠杆菌的方法。原核表达方法具有实验周期短，易于培养、生长以及使得实验耗费少等优点[9]。目前原核表达已被大量使用于蛋白定位、蛋白体外大量表达、蛋白纯化及功能分析等方面[10]。陈丽娜[11]将拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的AtGT-3b基因克隆于原核表达载体pColdTF中，选取大肠杆菌BL 21进行融合表达,后通过纯化得到大量的AtGT-3 b融合蛋白,基于此进一步研究其AtGT-3b基因与GT-1顺式作用元件在体外的相互作用。肖圣燕等[12]将桑树几丁质酶基因Machi1与载体pET-28a连接，转化至Rosetta(DE3)菌株，经纯化后用得到的高纯度Machi 1蛋白制备Anti-Machi 1多克隆抗体。

本研究使用大肠杆菌表达系统异源表达了pMCSG 19-ZaCHIT1基因重组载体，且优化了其在体外的诱导表达体系，得到了在体外大量表达的ZaCHIT 1融合蛋白和纯化后的重组ZaCHIT 1融合蛋白，为后续研究ZaCHIT1基因对植物中抗真菌的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与材料

原核表达载体菌株DH 5α-pMCSG 19-ZaCHIT1由武汉转导生物实验室有限公司构建。Premixed protein marker(Low)购自TaKaRa(大连)公司。蛋白纯化试剂盒购自康为世纪公司。

1.2 DH 5α-pMCSG 19-ZaCHIT1重组载体转入大肠杆菌BL 21(DE 3)及验证

以武汉转导生物实验室有限公司构建的DH 5α-pMCSG 19-ZaCHIT1菌种为模板，进行LB(100 mg·L-1Ampicillin，Amp)固体培养基平板划线37 ℃下培养24～36 h，挑单菌落于LB(100 mg·L-1Ampicillin，Amp)液体培养基中37 ℃摇床中培养12 h。引物为P 1-CGGGATCCATGAAGAAGGGCAATTTGGGA和P 2-CGGAATTCTCAAGACGAGGCATCTGCA进行菌落PCR验证。PCR 反应体系为：菌液模板 2.0 μL，10×buffer 2.0 μL，rTaq酶0.1 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1)1.6 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O补足总体系至20.0 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，59.0 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)一共30个循环，72 ℃ 3 min。将 PCR 扩增产物经过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，提取验证为阳性的菌株质粒送武汉转导生物实验室有限公司测序。

同时阳性质粒热激法转化表达于菌株BL 21(DE 3)感受态后，涂在LB(100 mg·L-1Ampicillin，Amp)固体培养基上，次日挑选单菌落，37 ℃摇床180 r·min-1培养12 h后提取质粒作为模板进行PCR验证，PCR反应体系为：质粒模板0.5 μL，上下游(F、R)引物各0.2 μL，rTaq酶5 μL，ddH2O补足总体系至10.0 μL。PCR 反应程序为：94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，59.0 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min)总计35个循环，72 ℃ 3 min。将产物使用琼脂糖凝胶电泳法(1.2%)进行检测，证实成功导入pMCSG 19-ZaCHIT重组表达载体。

1.3 ZaCHIT基因的原核表达

在5 mL含有LB液体培养基(Ampicillin，Amp，100 mg·L-1)中接种pMCSG 19-ZaCHIT菌株，温度为37 ℃、转速为180 r·min-1的摇床中培养，待菌液吸光度OD600值为0.7左右时，加入IPTG(终浓度为1 mmol·L-1)，在100 r·min-1转速下培养12 h，将菌液16 000 r·min-1、2.5 min离心后弃掉上清，用500 μL Tris HCl溶解缓冲液(Tris HCl pH=7.4，200 mmol·L-1NaCl，1 mmoL·L-1DTT)重悬菌体，在冰上超声破碎菌体后，加入2倍上样缓冲液后，进行10 min沸水浴，15%SDS-PAGE凝胶电泳分析检测，上样量为20 μL。

1.4 不同诱导条件对ZaCHIT重组蛋白原核表达的影响

将pMCSG 19-ZaCHIT的单菌落挑入在100 mL的LB液体(Amp，100 mg·L-1)培养基中，温度为37 ℃、转速为180 r·min-1的摇床中培养，培养至菌液吸光度OD600值为0.7左右时。进行诱导时长，诱导温度，IPTG终浓度3个方面的单因素实验以得到最优最大累积量的ZaCHIT重组蛋白。诱导时长(9 h，10 h，11 h，12 h，13 h，14 h)、诱导温度(16 ℃，25 ℃，37 ℃)、IPTG诱导浓度(0.5 mmol·L-1，0.8 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1，1.2 mmol·L-1，1.5 mmol·L-1)。诱导后13 000 r·min-1转速下离心2.5 min，用同等体积的Tris-HCl溶解缓冲液重悬菌体沉淀，在冰上超声破碎菌体后，加入2倍上样缓冲液，进行10 min沸水浴，15% SDS-PAGE凝胶电泳分析检测，上样量为20 μL。

1.5 ZaCHIT重组蛋白表达形式的鉴定

培养100 mL pMCSG 19-ZaCHIT菌液，当检测OD600值为0.7左右时，加入终浓度为1 mmol·L-1IPTG，在诱导温度为37 ℃，100 r·min-1的条件下诱导时长达到14 h。13 000 r·min-1转速下离心2.5 min收集菌体。菌体沉淀用Tris HCl溶解缓冲液重悬后冰上超声破碎，充分破碎后13 000 r·min-1转速下离心4 min，上清液转移到新的1.5 mL离心管中。再用2 mL的Tris HCl溶解缓冲液重悬沉淀，对其进行上样量为20 μL的15% SDS-PAGE 凝胶电泳检测。

1.6 Ni-NTA亲和层析纯化方法纯化ZaCHIT重组蛋白

使用蛋白纯化试剂盒方法，平衡Ni柱后上样，用不同浓度的咪唑亲和洗脱液(20 mmol·L-1Tris-HCl，0.3 mol·L-1NaCl，200、300、500 mmol·L-1Imidazole)进行洗脱柱子并收集不同浓度咪唑纯化后蛋白。对得到的不同浓度咪唑纯化后蛋白进行15% SDS-PAGE凝胶电泳分析检测。

1.7 Western Blot方法鉴定ZaCHIT 1重组蛋白

采用Western blot法(以40 kDa大小的对照样品进行对照)，用15% SDS-PAGE分离ZaCHIT 1重组蛋白后，电转膜1.5 h转移到PVDF膜上。转膜后取出，用PBST溶液清洗过的PVDF膜于1%酪蛋白封闭液中浸没，于37 ℃孵育2 h。再用PBST溶液清洗。将膜取出后，加入一抗华美鼠单克隆抗体(1∶1 000稀释)和二抗羊抗小鼠IgG(1∶3 000稀释)，先后孵育60 min后，再转移至PBST溶液容器中清洗3次。最后使用ECL法检测扫描成像。

2 结果与分析

2.1 ZaCHIT1基因及原核表达载体转入大肠杆菌BL 21(DE 3)的验证

将武汉转导生物实验室有限公司构建的DH 5 α-pMCSG 19-ZaCHIT1活化后，经过菌落PCR验证(图1)为阳性克隆。PCR扩增得到的目的条带与预期相符合，大小约为969 bp。测序结果显示，NCBI上登录的序列与结果序列一致，说明获得的目的条带确为ZaCHIT1基因。

将pMCSG 19-ZaCHIT1转入大肠杆菌感受态BL 21(DE 3)中扩增。挑取单菌落进行菌落PCR后得到结果，PCR扩增得到的目的条带与预期相符合(图2)，得到预期969 bp大小的片段。

2.2 ZaCHIT1基因的原核表达

用上步检测出的pMCSG 19-ZaCHIT1原核表达阳性菌株摇菌后进行原核诱导表达，加入IPTG(终浓度为1 mmol·L-1)，在16 ℃下诱导表达时长达到12 h。进行15% SDS-PAGE电泳发现(图3)：在77.51 kDa左右出现特异性条带，成功表达出预期77.51 kDa大小的融合蛋白条带(MBP 42 kDa+ZaCHIT135.51 kDa)，但条带特异性不强，需提高其目的蛋白表达量。

2.3 优化ZaCHIT1基因原核表达体系

2.3.1诱导时长对ZaCHIT1基因原核表达的影响

在pMCSG 19-ZaCHIT1菌液中加入IPTG(终浓度为1 mmol·L-1)，诱导温度为16 ℃，诱导表达不同的时长。菌体经过离心重悬后，进行15% SDS-PAGE凝胶电泳分析，通过图4可看出，诱导9～14 h之内，诱导时长对特异性融合蛋白表达量没有显著影响，最适的诱导时长为14 h，因为在诱导14 h后的产物中目的蛋白表达量相对较大。

2.3.2温度对诱导表达的影响

在pMCSG 19-ZaCHIT1菌液中加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG，分别在16 ℃，25 ℃，37 ℃下诱导表达14 h。菌体经过离心重悬后，进行15% SDS-PAGE 凝胶电泳分析，通过图5可看出，在16～37 ℃区间内，诱导温度为37 ℃时表达条带最亮，而16 ℃和25 ℃表达条带相对较弱，表明较适宜的ZaCHIT 1重组蛋白诱导温度为37 ℃。

2.3.3IPTG浓度对诱导表达的影响

在pMCSG 19-ZaCHIT1菌液中分别加入5个梯度不同终浓度(0.5 mmol·L-1，0.8 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1，1.2 mmol·L-1，1.5 mmol·L-1)的IPTG，在37 ℃下诱导表达14 h。菌体经过离心重悬后，进行15% SDS-PAGE凝胶电泳分析，通过图6可看出，在终浓度为0.5～1.5 mmol·L-1IPTG诱导区间内，ZaCHIT 1蛋白的表达量对于加入IPTG的浓度并没有显著性差异，最适的IPTG诱导浓度为1 mmol·L-1，因为在IPTG诱导浓度为1 mmol·L-1时，诱导后的产物中目的蛋白表达量相对较大。

2.4 ZaCHIT 1重组蛋白表达形式的鉴定

将pMCSG 19-ZaCHIT1菌液加入终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG后，在37 ℃下诱导表达14 h，菌体经过离心重悬后，再次离心后收集上清液和沉淀，进行15% SDS-PAGE凝胶电泳分析，由图7看出，上清中的特异性融合蛋白条带较之沉淀中的特异性融合蛋白条带有明显的差异，可得到ZaCHIT 1重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。

2.5 ZaCHIT 1重组蛋白在亲和层析纯化中纯化

利用蛋白纯化试剂盒中Ni-NTA系统对pMCSG 19-ZaCHIT1诱导后蛋白上清液进行纯化，收集经过不同浓度咪唑洗脱液(200、300、500 mmol·L-1)洗脱的蛋白组分进行电泳分析，结果见图8；可以看出，在经过300 mmol·L-1咪唑洗脱液后的ZaCHIT 1重组蛋白浓度最大，ZaCHIT 1重组蛋白特异性条带在77.51 kDa处。

2.6 ZaCHIT 1重组蛋白Western Blot的鉴定

利用His标签抗体对ZaCHIT 1重组蛋白进行鉴定，通过ECL法，从图9看出，在77.51 kDa处显现出特异性目的条带，但在35.51 kDa处也出现了条带，推测应为MBP标签断裂后，只带有了His标签的ZaCHIT 1重组蛋白。证明在BL 21(DE 3)菌株中已经正确表达出ZaCHIT 1重组蛋白。

3 讨 论

目前对于花椒抗菌基因功能研究和体外获得、分析的研究还较少[13]，基本只集中在化学物质分离和花椒中成分分析纯化阶段[14-15]。而本实验组前期已证实几丁质酶存在于花椒的各部位，但未对花椒中几丁质酶的作用进行详细研究。本研究通过基因工程技术构建了重组表达质粒pMCSG 19-ZaCHIT1，转化至大肠杆菌感受态BL 21(DE 3)中进行ZaCHIT 1重组蛋白分泌表达。

目前，在原核表达使用融合表达方法也愈来愈广泛，因其可使在胞质中更易得到正确折叠的外源蛋白，同时也更方便蛋白质的进一步纯化[16]。其中使用较多的融合蛋白就有麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)，且有研究发现，在大肠杆菌中的MBP可直接与外源蛋白相结合，起到分子伴侣的作用，可有利于外源蛋白的折叠[17]。本研究为了更方便使ZaCHIT 1重组蛋白表达，从而构建了含MBP标签和ZaCHIT1基因共计大小为77.51 kD的融合蛋白条带。为了获得更多的可溶性重组蛋白，分别从IPTG浓度、诱导时长和诱导温度这3个方面优化了融合蛋白的表达条件。最终在37 ℃，1.0 mmol·L-1的IPTG浓度优化条件下诱导表达14 h后成功表达了ZaCHIT 1重组蛋白，同时本研究通过原核表达系统成功使可溶性蛋白在浓度为300 mmol·L-1咪唑洗脱液下表达，经过western blot分析也成功验证了在BL 21(DE 3)菌株中可正确表达出ZaCHIT 1重组蛋白。为后续研究ZaCHIT1基因对植物中抗真菌的作用机制奠定基础。