固定化培养对纤细裸藻的生长与生理及其对废水无机氮的去除效果

李 旸，王祎哲，孙小雨，贾旭颖，周文礼，高金伟，邵 蓬，窦 勇

(天津农学院水产学院/天津市水产生态与养殖重点试验室，天津 300384)

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 微藻 纤细裸藻(Euglenagracilis)由天津市水产生态及养殖重点实验室提供。基础培养基为去离子水配制的经121.3 ℃条件下灭菌20 min的AF-6培养基。培养温度为(25±1) ℃，光照强度为55 μmol/(m2·s)，光暗比12 L∶12 D。每天至少3次定时摇动藻液，防止其贴壁或沉淀。

1.1.2 试验试剂 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒来源于北京索莱宝科技有限公司，其余化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 固定化藻球的制备 微藻培养至对数期(细胞密度为1.8×106cell/mL)，离心浓缩，弃去上清液，取一定体积的微藻细胞浓缩液混合于4%海藻酸钠溶液中，用10 mL注射器在距离预冷的2% CaCl2溶液水面20 cm处以60滴/min左右的速度滴入，形成小球状。滴入的藻液进入CaCl2溶液后形成藻珠后，静置1 h，灭菌去离子水洗涤多次后备用，培养12 d，培养条件同1.1.1。

1.2.2 小球藻胶球解固定 从培养液中取出一定数量的藻珠，滴加一定量的3%的柠檬酸钠(C6H5Na3O7)溶液，静置至藻珠完全溶解。

1.3 测定方法

1.3.1 细胞密度测定 每2 d取样，采用血球计数板法[20]对藻细胞密度进行测定。根据公式(μ=(lnN-lnN0)/(t-t0) 计算相对生长速率，其中，μ为相对生长速率,N、N0分别为t时刻的藻密度、t0(初始)时刻藻密度。

1.3.2 色素含量测定 每2 d取样，用乙醇法[21]对藻类进行测定的方式测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量。样品离心弃上清，加入95%乙醇溶液于4 ℃冷藏24 h，经离心后取上清，测定各波长下吸光值。

Ca(mg/L)=13.95A665- 6.88A649

(1)

Cb(mg/L)=24.96A649- 7.32A665

(2)

Cc(mg/L)=(1000A470- 2.05Ca-114.8Cb)/245

(3)

式中：Ca、Cb、Cc分别为叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的浓度。A665、A649和A470分别为色素提取液在波长665、649和470 nm下的吸光度。

1.3.3 抗氧化指标测定 在第0、6、12天取样离心，收集藻细胞。按照对应的试剂盒使用说明进行超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA测定。SOD酶活性单位定义为在黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为1个酶活力单位。

1.4 数据处理与统计分析

数据采用Excel 2019分析处理，利用GraphPad Prism 7.0软件绘图，采用SPSS 17.0进行T检验(T-test)，显著性水平设为P≤0.05。

2 结果与分析

2.1 固定化培养对纤细裸藻生长的影响

如图1-a所示，两处理组的细胞密度均呈上升趋势，并且固定化组的细胞密度始终高于对照组。试验前2 d，固定化组的细胞密度略大于液体悬浮化，但未产生显著差异(P>0.05)。至第4 天，两处理组产生显著差异(P<0.05)，试验结束时(12 d)，固定化纤细裸藻细胞密度达到最大，为5.6×106cell/mL，为对照组细胞密度的1.42倍。如图1-b所示，固定化纤细裸藻细胞密度的相对增长率显著高于对照组(P<0.05)，为对照组的1.52倍。

2.2 固定化培养对纤细裸藻光合色素的影响

如图2-a所示，前4 d，液体悬浮态叶绿素a含量高于固定化组，但差异不显著(P>0.05)。第6天起，固定化组叶绿素a含量均高于对照组，且在第6、8、12天差异显著(P<0.05)。试验结束时(12 d)，固定化组的叶绿素a含量为对照组的1.19倍。如图2-b所示，前4 d，液体悬浮态叶绿素b含量高于固定化组，但差异不显著(P>0.05)。第6天起，固定化组叶绿素b含量均高于对照组，且在第6、12天差异显著(P<0.05)。两处理组的叶绿素b含量均在第10天达到最大值，而后出现下降。第12天，固定化组的叶绿素b含量为对照组的1.18倍。如图2-c所示，前4 d，两处理组的类胡萝卜素差异不显著(P>0.05)。第6 天起，固定化组类胡萝卜素含量均高于对照组，且差异显著(P<0.05)。试验结束时(12 d)，固定化组类胡萝卜素含量为对照组的1.66倍。如图2-d所示，前4 d，液体悬浮态总光合色素含量高于固定化组，但差异不显著(P>0.05)。第6天起，固定化组总光合色素含量均高于对照组，且在第6、8、12天差异显著(P<0.05)。试验期间，固定化组的总光合色素含量持续升高，在12 d达到峰值，为对照组的1.3倍。

2.3 固定化培养对纤细裸藻抗氧化相关指标的影响

如图3-a所示，试验期间，固定化组的SOD呈先降低后升高的趋势，在试验结束时(12 d)出现最大值。而对照组SOD逐渐降低，在试验开始时(0 d)出现最大值。前6 d，两处理组的SOD差异不显著(P>0.05)。第12天，固定化组SOD大幅升高，两处理组SOD差异显著(P<0.05)，固定化组为对照组的1.34倍。如图3-b所示，两处理组的MDA均呈先降低后升高的趋势，且最大值均在试验结束时(12 d)出现。前6 d，两处理组的MDA差异不显著(P>0.05)。第12天，液体悬浮态处理组MDA大幅升高，两处理组MDA差异显著(P<0.05)，对照组为固定化组的1.18倍。

2.4 固定化培养对纤细裸藻无机氮去除效果的影响

3 讨 论

3.1 固定化培养对纤细裸藻生长的影响

藻细胞密度客观地反映了微藻的生长状况[23]，固定化培养在一定程度上改变了藻细胞的生存环境和其自身的适应性。在本研究中，固定化纤细裸藻出现了2 d的生长延迟期，从第4天起细胞密度大幅增长，最终高于对照组。毛欣欣等[24]以海藻酸钠(SA)固定培养原绿球藻(Prochlorococcus)，固定化处理组出现生长延迟的现象，与本试验结果一致。汪洋等[25]以海藻酸钙(CAS)制备固定化小球藻，发现悬浮态小球藻虽然生长速率较快，但生长周期短，在经历对数期后生长迅速衰退；而固定化组虽然生长速率比较缓慢，但生长周期长，而且可重复利用，有利于构建固定化生物催化和生物转化体系。由此可知，固定化技术有利于藻细胞生长，但在初期会出现生长延迟，这是由于固定化限制了藻细胞的生长空间，细胞聚集出现自遮蔽现象使光穿透率下降[26]。相比之下，液体悬浮态初期的光合作用较强，生长速度较快，但易进入稳定期与衰亡期，减缓生长速度，这可能与空间竞争和营养物质快速耗尽有关。除此之外，固定基质和藻酸盐基质之间的离子相互作用所引起的物理压力会改变细胞周围的微环境，也可能会使生长出现延迟[27]。

3.2 固定化培养对纤细裸藻色素含量的影响

光合色素是藻类捕光和传递光量子的重要成分[28],其变化可直接反映光合作用的效率，而光合作用与藻类的生长状态密切相关。纤细裸藻的光合色素主要包括叶绿素和类胡萝卜素[29]。叶绿素a在藻细胞捕光系统中起主要作用[30]，叶绿素b可以有效地捕捉并利用蓝紫光进行光合作用[31]，类胡萝卜素不仅具有捕光功能，还参与光保护并对环境刺激发生响应[32]。总光合色素体现细胞进行最优光合作用的所有色素的动态平衡[33]。

试验初期(前4 d)，固定化组的叶绿素a与总光合色素含量均略低于悬浮态藻组，叶绿素b和类胡萝卜素差异不显著。从第6天起，固定化组的光合色素增含量迅速升高，与对照组差异显著，对照组光合色素增加缓慢甚至降低。固定化培养对纤细裸藻中后期的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、总光和色素含量都有很大程度的增加，说明固定化细胞初期处于环境胁迫中且色素合成被抑制。Matthew 等[27]研究发现，固定化培养对藻类营养物质的吸收和代谢有影响。推测是由于固定化纤细裸藻空间受限，前期生长较缓慢，并且对物质能量消耗也有所降低所导致。而后期随细胞密度增大，光合作用也会大幅增加。高鹏等[34]发现固定化铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)可提高微藻的合成代谢，这可能是固定化微藻光合作用优于液体悬浮态微藻的原因之一。试验后期对照组缺乏对营养物质的合成代谢会降低光合速率，修复率和光化学效率，从而影响光合系统[35]。因此，固定化培养提高了纤细裸藻的合成代谢，从而使纤细裸藻的色素含量增加且色素下降时间得到了延缓。

3.3 固定化培养对纤细裸藻抗氧化指标的影响

超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化酶防御系统中的重要保护酶[36]，在机体抗氧化和抗氧化能力的平衡中起着至关重要的作用[37]。本试验中，固定化处理组呈先降低再升高的趋势，而悬浮态处理组出现逐渐降低的趋势。前6 d，两处理组差异显著(P>0.05)，至第12天，固定化处理组增加迅速，两组出现显著差异(P<0.05)。由此推测，固定化纤细裸藻初期受到环境胁迫，生长速度较慢，藻细胞需要一段缓冲期，以合成抗氧化酶。细胞引起的氧化应激可在许多种类的光合作用微藻中诱导产生抗氧化剂，从而增加了酶促抗氧化剂(例如超氧化物歧化酶)和非酶促抗氧化剂(例如胡萝卜素)的含量增加[38]。当固定化纤细裸藻进入生长对数期，酶活力加强，而液体悬浮态纤细裸藻已进入稳定期或衰退期。因此，固定化培养可延长微藻的生长周期。有研究发现，以35‰的盐水胁迫游离态和4种以不同条件固定化的小球藻后，4种固定化小球藻的SOD活性均以不同程度高于BG11培养液中的小球藻[39]，与本试验结果一致。说明固定化培养微藻可以有效提高藻细胞的SOD活性，使其抗逆能力增强。

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的最终产物[40]，它能反映机体的脂质过氧化速率和强度，并间接反映组织过氧化损伤的程度[41]。本研究中，两处理组的MDA含量均呈先降低在升高的趋势。试验前期两个处理组差异不显著(P>0.05)，试验结束时(12 d)，液体悬浮态组MDA显著高于固定化组(P<0.05)。这可能是由于本试验中所用的固定化载体海藻酸钠(SA)会对纤细裸藻造成轻微胁迫，细胞会受到轻微损害。固定化组在试验初期MDA含量较高，随后，藻细胞逐渐适应固定化环境并开始迅速增长， MDA含量有所下降，反映出抗氧化保护增强。而试验后期固定化处理组细胞密度过高，其生长环境有所恶化，导致MDA含量升高。但与对照组相比不难发现，固定化培养纤细裸藻可以有效降低细胞损伤。有研究表明，以水产养殖废水胁迫游离态和4种以不同条件固定化的小球藻后，4种固定化小球藻MDA含量均以不同程度低于BG11培养液中的小球藻[39]，与本试验结果一致。

3.4 固定化培养对纤细裸藻无机氮去除效果的的影响

4 结 论