碳氮磷营养对百蕊草悬浮培养细胞生长的影响

黄燕芬 ，王自布，施 琴 ，谢 奇

(1.贵州师范学院生物科学学院，贵州 贵阳 550018；2.贵州省生物资源开发利用特色重点实验室，贵州 贵阳 550018)

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为用野生百蕊草叶为外植体诱导的生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织。

1.2 方法

1.2.1 悬浮培养细胞系的建立及培养基质中碳、氮、磷消耗量检测 取供试愈伤组织，切成小块或夹碎接种于液体培养基BRCIII (MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L+30 g/L蔗糖，pH 5.7～5.9)中培养。培养温度(24±1)℃，培养箱转速115 r/min，每个锥形瓶(容量100 mL)内装40 mL培养液，每瓶接种量约2 g，于黑暗处培养2～3 d后转移至弱光处培养。在悬浮培养初期(3～5 d)用0.425 mm的无菌过滤筛对培养物过滤1次，除去大细胞团和组织块，保留分散程度好的小细胞团及单细胞。每3 d 显微观察1次，并弃去上液，按1/3体积比(原液/新鲜培养液)转入新鲜培养液。观察见细胞团较小，分散度、均一性较好，悬浮细胞呈浅黄色，生长状态稳定，生物量迅速增加时即可作为种子细胞液。取1份种子细胞液、3份新鲜培养液进行悬浮培养，每间隔2 d 取1次悬浮细胞培养液(连续取样30 d)，测定细胞生长量，绘制悬浮细胞生长曲线，同时测定培养基质中碳、氮、磷消耗量。

1.2.2 筛选培养基质最适氮、磷源浓度 将培养基BRCIII中总氮设置7种起始浓度，即50、55、60、65、70、75和80 mmol/L，磷酸盐设置5种起始浓度，即1.20、1.25、1.30、1.35和1.40 mmol/L，均为3次重复。按照1.2.1方式接种种子细胞液于不同氮、磷起始浓度培养基中培养至第28天时，分别测定细胞干物质量，筛选最适氮、磷起始浓度。

1.2.4 细胞生长情况检测 用布氏漏斗抽滤悬浮培养系除去培养液，再以蒸馏水冲洗、抽滤3次，尽量抽去胞间隙水分，最后将细胞于50 ℃烘干至恒重[15]，按照下列公式计算细胞干物质量和细胞生长速率。

细胞干物质量(g/L)=收获细胞的干物质量(g)-接种细胞的干物质量(g)

细胞生长速率[g/(L·d)]=细胞干物质量(g/L)/培养天数(d)

1.2.5 培养基质碳、氮、磷营养的测定方法 以培养液离心得到的上清液为待测液，分别采用苯酚硫酸法(略改动)测定总糖含量[16]、蒽酮比色法测定蔗糖含量[17]、3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量、水杨酸—浓硫酸法测定硝态氮含量、苯酚—次氯酸盐法测定铵态氮含量[18]；钼蓝比色法(略改动)测定磷酸根含量[19]。

1.2.6 数据统计与分析 采用Excel 2010整理原始数据，SPSS 17.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 悬浮培养细胞生长规律

从图1看出，在30 d的培养过程中，悬浮细胞生长曲线出现较明显的延滞期(0～6 d )、对数生长期(7～15 d )、稳定生长期(16～24 d )和衰亡期(24 d 后)，生长速率的变化情况与之相符。延滞期细胞刚转入盐浓度和渗透压均较高的培养液中，处于适应阶段，前3 d生长比较缓慢，干物质量变化不大，后3 d开始上升；培养7～15 d 时细胞经过延滞期物质和能量的准备，分裂活跃，生长迅速，在15 d时干物质量达第1个峰值，生长速率达最高峰，呈现良好的生长状态；培养16～24 d 时，细胞干物质量继续增加，上升相对趋于平稳，至24 d时达第2个生长高峰，而生长速率则是先迅速下降之后有少许上升；细胞培养24 d后干物质量缓慢下降，到30 d时下降到9.70 g/L，生长速率则从0.12 g/(L·d)急速下降到0.07 g/(L·d)。原因可能是随着培养时间延长，瓶内营养条件和环境不利于继续培养，细胞开始衰亡。因此，细胞悬浮培养适宜的继代周期确定为15～24 d，最长培养时间不宜超过30 d。

2.2 培养液中碳、氮、磷营养的消耗量

2.2.1 碳营养 百蕊草细胞悬浮培养液中碳源为蔗糖，当蔗糖逐渐水解为还原糖后，总糖含量不变，蔗糖的浓度快速降低，还原糖的含量迅速增加。从图2看出，在培养0～9 d期间因细胞长势缓慢总糖的消耗速度较慢；对数生长期至稳定生长期因细胞持续生长，总糖消耗量大，消耗速度比较均衡；衰亡期后总糖消耗缓慢，到培养30 d时只剩0.45 mg/mL。蔗糖含量在延迟期因大量水解快速降低，从24.3 mg/mL降至3.55 mg/mL；进入对数生长期后含量已较低变化较小，对数生长期结束时(24 d)含量仅0.17 mg/mL。还原糖在延滞期由起始培养时的3.14 mg/mL快速上升到22.65 mg/mL，原因是蔗糖水解为能被植物细胞吸收的还原糖(葡萄糖和果糖)，但细胞还未进入快速生长阶段，消耗量较少；从进入对数生长期开始，还原糖作为直接碳源，变化趋势与总糖大体一致，随着细胞的快速生长，被大量消耗，呈现持续快速下降趋势，由21.80 mg/mL下降至1.65 mg/mL。到衰亡期消耗开始减慢，变化幅度明显变小。

图1 悬浮细胞不同培养时间百蕊草的细胞干物质量和生长速率Fig.1 The dry matter mass and growth rate of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different culturing time

2.2.2 氮营养 从图3看出，在延滞期硝态氮消耗量较低，仅11.43%，铵态氮被迅速利用，消耗83.87%。进入对数生长期硝态氮含量快速下降，到培养15 d时只剩24.07%，铵态氮剩6.38%，此时细胞处于第1个生长高峰，基质中的大部分氮源被消耗。第2个生长高峰(24 d)细胞生长仍以吸收硝态氮的为主，铵态氮低幅下降。培养30 d时，硝态氮含量为2.06 mmol/L，铵态氮0.61 mmol/L。可见，氮对于悬浮培养细胞的生长影响较大，铵态氮的吸收利用优先于硝态氮，但是需求量则是硝态氮大于铵态氮。

2.2.3 磷营养 磷是植物细胞中核酸、核蛋白、磷脂、磷酸腺苷和多种酶等的组成成分，在植物细胞代谢中起着重要作用。从图4看出，培养液磷酸盐的含量与悬浮培养细胞生长密切相关。培养期间磷酸根离子被大量吸收，在延滞期内消耗达33.87%；进入对数生长期细胞生长旺盛，磷酸根离子的消耗量显著增大，至稳定生长初期培养液中磷酸根离子含量仅为15.20%；随着培养时间的增加，因细胞生长速率的下降磷酸根离子消耗幅度变小，培养30 d时磷酸根离子为4.24%，几乎耗尽。

图2 百蕊草悬浮培养细胞碳的消耗量Fig.2 The carbon consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

图3 百蕊草悬浮培养细胞氮的消耗量Fig.3 The nitrogen consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

2.3 培养液中氮、磷源起始浓度对悬浮细胞生长的影响

2.3.1 氮源 氮源是悬浮培养细胞生长的重要营养物质，适宜的氮浓度对于悬浮细胞生长有促进作用。从图5看出，在培养28 d时百蕊草悬浮细胞干物质量随着氮浓度的增加不断上升，当氮浓度达70 mmol/L时，干物质量达最大值9.71 g/L。随着氮浓度的继续增加，干物质量开始下降，说明细胞生长开始受到抑制。原因可能是随着氮浓度的增大，细胞内铵态氮的浓度相应增高，对细胞产生毒害作用而抑制细胞的生长。

2.3.2 磷源 从图6看出，不同磷酸盐初始浓度对百蕊草细胞增殖生长有着不同的影响。细胞悬浮培养28 d时，随着磷酸盐浓度从1.15 mmol/L增大到1.30 mmol/L，细胞干物质量表现出逐渐增加并达峰值；此后随着磷酸盐浓度升高，细胞干物质量逐渐减少，表明百蕊草细胞悬浮培养以1.30 mmol/L的磷酸盐浓度较适合。说明磷在百蕊草细胞生长代谢中起着重要作用，适宜浓度的磷促进细胞生长，过高或过低都不利于细胞的生长。

图4 百蕊草悬浮培养细胞磷酸盐的消耗量Fig.4 The phosphate consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

图6 百蕊草悬浮培养液中不同磷浓度下细胞的干物质质量Fig.6 The dry matter mass of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different phosphorus

图7 百蕊草悬浮培养液中不同下细胞的干物质质量Fig.7 The dry matter mass of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different concentration

3 讨 论

研究结果显示，培养周期内细胞对基质中碳、氮、磷营养的消耗动态变化与细胞各个增殖生长阶段的营养需求大体吻合。培养0～6 d，细胞适应新的生长环境，加之吸收的营养物质主要储存在细胞内为快速生长作准备，因此生长缓慢，但对营养物质吸收迅速，使得培养液营养物质消耗较大; 培养7～15 d， 细胞因大幅吸收培养液中营养物质和前期营养物质的储存充足，生长迅速，干物质量达第1个高峰，此时培养液营养物质浓度快速下降；15～24 d ，细胞干物质量缓慢上升，于24 d 达最大值，原因是在培养液营养物质浓度较低的情况下，细胞生长主要靠少量吸收培养液营养和消耗自身存储，生长速率短暂下降后逐渐恢复稳定上升; 培养24 d 之后，细胞中储存的营养物质和培养液中的营养物质不足，细胞生长进入衰亡期，生长速率迅速下降。可见培养液中碳源、氮源(硝态氮和铵态氮)、磷源的含量与细胞增长关系密切。因此，建立悬浮细胞培养体系时，为保证细胞能健康快速生长，摸清悬浮培养过程中细胞生长规律及其对基本营养物质的需求情况，确定其初始投入量至关重要。

氮是构成植物蛋白质、核酸、磷脂及其它生长发育所必需的有机氮化合物的重要成分，也是植物细胞生长、发育及次生代谢物产生必不可少的营养物质，对悬浮细胞生长具有重要影响。百蕊草细胞悬浮培养液中的氮源包括硝态氮和铵态氮，二者浓度的动态变化并不同步，此情况与南方红豆杉细胞悬浮培养的结果相近[20]。磷是植物体内的核酸、核蛋白、磷脂、植素、磷酸腺苷和多种酶的组成成分。核酸和核蛋白是细胞核与原生质的组成成分，在植物生命活动与遗传变异中具有重要功能。试验结果表明：不同起始浓度的氮和磷在悬浮细胞培养28 d时，在起始总氮浓度70 mmol/L及磷酸盐浓度1.3 mmol/L时，悬浮细胞培养的干物质量均达最大值，低于或者高于此两浓度均不利于细胞的健康生长。在此基础上进一步研究悬浮培养细胞对硝态氮、铵态氮的需求结果发现，培养过程中悬浮细胞生长对硝态氮的消耗多于铵态氮，铵态氮的浓度过高会抑制细胞生长。铵态氮和硝态氮的比例为20/50 最适于细胞生长。铵态氮的利用消耗先于硝态氮。

4 结 论