ZnT3经由ERK通路影响老年小鼠认知能力

于 洋，王小梅，田 鹤，梅晰凡，张振兴

(1. 锦州医科大学 附属第一医院，辽宁 121001；2. 锦州医科大学 基础医学院，辽宁 121001)

0 引言

随着社会经济和医疗卫生的发展，人们的寿命显著延长，老年人口高龄化趋势日益明显。伴随年龄的增加，机体的细胞、组织和器官不可避免地会发生生理性或病理性的改变，身体机能逐渐减弱[1]。大脑是人体耗氧量最大的器官，对衰老非常敏感，在脑衰老过程中，大量神经细胞死亡，突触数量减少，学习记忆能力显著下降[2-3]。锌离子作为人体内含量第二丰富的微量元素，与神经元的存活和功能关系密切。锌离子不能自由通过生物膜，其运输主要依靠锌转运体(Zinc transporters, ZnT)家族和锌转运蛋白(Zrt-Irt like proteins, Zip)家族[4]。ZnT3是维持中枢神经系统锌稳态的重要锌转运体之一，ZnT3基因敲除小鼠学习记忆能力显著下降[5]。在阿尔茨海默(Alzheimer’s disease, AD)模型小鼠的脑海马内ZnT3的表达量显著下降，锌离子稳态失衡，神经元凋亡增加[6]。在自然衰老过程中出现的学习记忆能力下降是否也与ZnT3有关，目前尚未见报道。因此，本研究应用Morris水迷宫测试衰老对小鼠学习记忆能力的影响，应用免疫组织化学、体视学和Western Blot技术对ZnT3在老年和青年小鼠海马内的定位分布和定量表达进行检测分析，并探索ZnT3影响学习记忆的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

C57BL/6J小鼠，雄性，2月龄12只，20月龄12只，体重25～30 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。小鼠饲养于锦州医科大学实验动物中心SPF动物室，实验过程符合动物伦理标准。纳入实验的老年组小鼠血液生化指标检测正常。兔抗鼠ZnT3抗体(proteintech)、兔抗鼠P-ERK和ERK抗体(abcam)、兔抗鼠GAPDH抗体(abcam)，SP9000免疫组化染色试剂、DAB显色剂(北京中杉金桥生物公司)、BCA蛋白质定量试剂盒(碧云天生物公司)、羊抗兔二抗(abcam)、PVDF膜(millipore)、ECL发光液(诺唯赞生物科技有限公司)。

1.2 Morris水迷宫测试

青年组和老年组小鼠首先进行5 d定位航行实验，实验时间设为120 s，小鼠面向池壁放入水中，从入水到找到平台所需的时间即为潜伏期，若120 s内没有找到安全平台，将小鼠人为放置在平台上10 s，潜伏期记为120 s，每日训练两次。实验第6天进行空间搜索，撤走安全平台，记录60 s内小鼠穿越平台的次数。

1.3 小鼠脑组织取材及标本处理

随机挑选青年组和老年组小鼠各5只，腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)，小鼠麻醉后应用4%多聚甲醛灌注固定，迅速剥离出大脑，冠状面切开，放入4%多聚甲醛溶液中固定，流水冲洗组织标本，常规脱水，透明、浸蜡、包埋，切成5 μm薄片，用于免疫组织化学染色。另取青年组和老年组小鼠各7只，麻醉后快速取出全脑组织，分离出海马，冻存于-80℃，用于Western Blot实验。

1.4 免疫组织化学染色方法检测小鼠脑海马组织中ZnT3的表达

应用SP法检测小鼠脑组织中ZnT3蛋白的表达：石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，高压修复抗原，PBS漂洗3次后加入山羊血清，封闭10 min后甩掉血清，滴加兔抗鼠ZnT3抗体(1∶200)，4℃孵育12～16 h。PBS漂洗后，依次滴加多聚物和HRP标记的羊抗兔IgG，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明后封片。

1.5 体视学方法检测小鼠脑海马组织中ZnT3的表达量

青年组和老年组各随机选取5张ZnT3免疫组化染色阳性图片，每张图片按照“S”形选取5个高倍视野，应用目镜方格测试系统、点记数法测算ZnT3的体密度值。公式如下：VV=ΣPX/ΣPC，PX为方格测试系统落在阳性表达部位的点数，PC为方格测试系统落在参照系的点数。

1.6 免疫印迹方法检测小鼠脑海马组织中ZnT3、P-ERK和ERK蛋白含量

取-80℃保存的小鼠海马组织，裂解提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，加入SDS上样缓冲液，加热至100℃变性。12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，恒压湿转法转印到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗鼠ZNT3 (1∶500)、兔抗鼠P-ERK (1∶1000)、兔抗鼠ERK (1∶1000)、兔抗鼠GAPDH (1∶3000)，4℃孵育16 h。TBST洗膜3次后加入羊抗兔IgG (1∶5000)，室温孵育2 h，TBST洗膜后应用ECL法显色，应用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.7 统计分析

使用GraphPad Prism 5.0软件统计分析数据，用均数±标准差表示数据，应用ANOVA检验，组间比较用t检验，P<0.05认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 青年小鼠和老年小鼠学习记忆能力比较

Morris水迷宫实验结果见图1、图2。随着训练时间的延长，老年小鼠和青年小鼠寻找安全平台的潜伏期均减少，但是同一训练时间，老年小鼠的逃避潜伏期明显长于青年小鼠。空间探索实验显示老年小鼠穿越平台次数明显少于青年小鼠。这些结果表明，老年小鼠学习记忆能力明显减退，衰老影响了认知能力。

图1 青年和老年小鼠逃避潜伏期比较注：组间比较，*P<0.05,** P<0.01

图2 青年和老年小鼠穿越平台次数比较注：组间比较，*P<0.05,** P<0.01

2.2 青年小鼠和老年小鼠脑海马组织内ZnT3表达情况比较

免疫组织化学染色结果显示ZnT3表达于小鼠海马CA1区、CA3区以及齿状回(DG)内锥体神经元和颗粒细胞的胞质，阳性反应产物呈棕褐色。与青年小鼠比较，ZnT3在老年小鼠海马CA1区和CA3区的阳性表达均显著减少，齿状回内ZnT3的阳性表达也弱于青年组(图3)。体视学测量结果显示，老年小鼠海马组织CA1区、CA3区和齿状回内ZnT3阳性表达的体密度值低于青年小鼠(表1)。免疫印迹结果与体视学结果一致，老年小鼠海马组织中ZnT3蛋白含量下降明显(图4A, B)。

图3 青年小鼠和老年小鼠脑海马内ZnT3表达(SP，scale bar =100 μm)

表1 青年小鼠和老年小鼠脑海马组织内ZnT3体密度值

续表

2.3 青年小鼠和老年小鼠脑海马组织内P-ERK和ERK蛋白含量比较

细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)属于MAPK家族，磷酸化的ERK从胞质进入胞核，介导多种因子的转录分化。本实验的免疫印迹结果显示，老年小鼠海马组织中ERK蛋白激酶的活性下降，P-ERK/ERK比值明显小于青年组(图4A, C)。

图4 青年小鼠和老年小鼠脑海马组织内ZnT3、P-ERK、ERK蛋白含量比较A：免疫印迹条带；B：ZnT3含量分析；C：P-ERK/ERK，** P<0.01

3 讨论

随着科技的发展，人们的平均寿命大幅度延长，我国的人口老龄化问题日益严重。衰老不仅导致身体机能下降，也是造成AD和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等神经退行性疾病的主要风险因素[7]。神经系统作为人体重要的调节中枢最易受衰老影响，在衰老逐渐进行的过程中脑组织萎缩、神经细胞坏死凋亡、认知能力退化、学习记忆能力下降[8]。脑衰老的机制极为复杂，建立衰老模型是探索衰老机制的前提，本研究应用饲养20个月的小鼠进行研究，其病理变化最接近于自然衰老。通过Morris水迷宫检测证实20月龄的小鼠学习记忆能力明显减退，逃避潜伏期的时间明显长于青年小鼠，穿越平台次数明显少于青年小鼠。

锌是人体内第二丰富的微量元素，是多种酶和转录因子的组成成分，缺锌可导致学习记忆障碍[9]。神经元内的锌离子游离存在，依靠特定的转运体跨膜转运。ZnT3分布于突触小泡膜上，可向突触小泡内转运锌离子，在突触活动时，锌离子释放，发挥其神经调质功能，影响突触后神经元的功能活动[10]。文献报道，AD小鼠海马内ZnT3表达下降，其突触小泡内锌离子含量下降明显；ZnT3基因敲除小鼠学习及记忆能力明显减弱[11-12]。本研究通过免疫组织化学染色、体视学测量和免疫印迹技术检测了青年小鼠和老年小鼠海马组织内ZnT3的表达情况，结果显示，老年小鼠海马CA1区、CA3区以及齿状回内ZnT3的阳性表达均弱于青年小鼠。这一结果表明，衰老个体由于饮食等因素的影响，机体内锌离子含量减少，从而影响生理活动。同时，由于ZnT3表达的下降，会导致锌离子异常聚集于胞质，突触的功能受到抑制，加重学习记忆能力的损伤。

在中枢神经系统，ERK激酶是记忆形成的相关分子，海马神经元内ERK通路蛋白含量丰富，调控认知或发育[13]。文献报道，锌离子和锌转运体参与ERK信号通路的调控。ZnT3通过ERK通路影响神经元内质网的应激[14]。ZnT3基因敲除小鼠，其海马神经元再生能力下降，ERK信号通路被抑制[15]。本实验也检测到衰老小鼠海马组织内P-ERK/ERK比值下降，ERK通路磷酸化水平降低。这也证实，自然衰老的脑组织中ZnT3表达下降，突触小泡内锌离子含量减少，ERK通路被抑制，突触后神经元的功能受到影响，学习记忆能力下降。