LC-MS/MS法测定肉豆蔻中玉米赤霉烯酮含量的不确定度评定

倪 倩，张 俐，冯有龙

（江苏省食品药品监督检验研究院，江苏南京 210019）

肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻（Myristica fragransHoutt.）的干燥种仁[1]。味辛、温，具有温中行气、涩肠止泻的功效。肉豆蔻的主要成分为挥发油和脂肪油等，若贮存不当，极易发生霉变，产生真菌毒素[2-3]。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一种由镰刀菌属真菌产生的非甾体雌激素真菌毒素，是真菌产生的次生代谢产物，具有良好的热稳定性。玉米赤霉烯酮可导致人体产生免疫系统受损、内分泌紊乱和肝肾功能不全[4]。因此，检测肉豆蔻中的玉米赤霉烯酮具有重要意义。

由于测量误差不可避免，不确定度则表示了对测量结果不能肯定的程度，也可表明测量结果的可信赖程度[5-6]。本文参考《测量不确定度评定与表示》[5]与《化学分析中不确定度的评估指南》[6]对标准溶液配制拟合过程、样品称量过程、样品前处理过程进行评估，合成拓展不确定度，为肉豆蔻中玉米赤霉烯酮的检测提供更加准确可靠的结果。

1 材料与方法

1.1 仪器

ExionLC型超高效液相色谱仪，AB QTRAP 4500 LC/MS/MS（美国SCIEX公司）；CPA0045型万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；TG16-WS离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；Milli-Q超纯水处理系统。

1.2 试剂

混合真菌毒素对照品溶液（含玉米赤霉烯酮2.0 μg/ml，纯度99.9%，批号S075901），购自阿尔塔科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

精密量取0.5 mL混合真菌毒素对照品溶液，置100 mL量瓶中，用50%乙腈稀释至刻度，摇匀，即得线性1号溶液。精密量取线性1号溶液各1 mL，分别置2 mL、5 mL、10 mL与20 mL量瓶中，用50%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得线性2、3、4与5号溶液。

1.3.2 样品处理

取本品粉末约5 g（过二号筛），精密称定，精密加入70%甲醇溶液50 mL，超声处理30 min，离心，精密量取上清液10 mL，用水稀释至20 mL，摇匀。精密量取3 mL，缓慢通过已经处理好的HLB柱[规格：3 mL（60 mg）]，依次用甲醇和水各3 mL洗脱，直至有适量空气通过，收集洗脱液；随后用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，合并2次洗脱液，氮气缓慢吹至近干，加50%乙腈溶液定容至1 mL，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，取滤液。

1.3.3 色谱质谱条件

（1）色谱条件。采用Phenomenx Titank色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），流动相A为0.01%甲酸，流动相B为甲醇-乙腈（1∶1），梯度洗脱。洗 脱 程 序 为 0～ 2.0 min，5%B；2.0～ 2.1 min，5%B ～ 40%B；2.1～ 8.0 min，40%B～ 90%B；8.0～10.0 min，90%B；10.0～12.0 min，90%B～5%B。流速0.4 mL·min-1，柱温40 ，进样体积5 μL。

（2）质谱条件。离子源为电喷雾离子源（ESI源），负离子方式检测，离子化电压-4 500 V；离子源温度（TEM）700 ，喷雾气（GS1）、辅助加热气（GS2）和气帘气（CUR）压力分别为 55 psi、60 psi和 35 psi；碰撞气（CAD）Medium，MRM扫描模式，质谱参数见表1。

表1 玉米赤霉烯酮质谱参数

2 结果与分析

2.1 数学模型

试样中玉米赤霉烯酮的含量表示为：

式中：X-试样中玉米赤霉烯酮含量，μg/kg；c-试样溶液中玉米赤霉烯酮含量，ng；m-样品称样量，g；P-标准溶液影响因子；curve-标准曲线拟合影响因子。

合成标准不确定度为：

2.2 不确定度分量来源

本次试验的不确定度分量包括标准溶液配制过程、标准曲线拟合过程、样品称量过程、样品前处理过程。

2.3 各分量不确定度的计算评定

2.3.1 标准溶液配制引入的不确定度

（1）玉米赤霉烯酮标准物质的不确定度urel(S)。根据标准物质证书提供的玉米赤霉烯酮的标准不确定度为5%（k=2），可知玉米赤霉烯酮标准物质的相对标准不确定度为：

（2）标准溶液配制过程的引入不确定度u(P)。标准溶液配制过程中，所用到的玻璃量器为2 mL、5 mL、10 mL、20 mL与100 mL量瓶各1个，0.5 mL与1 mL移液管各1个。根据JJG196—2006常用玻璃量器可知最大允差，具体见表2。假设分布类型为三角分布（k=），可计算出由2 mL量瓶和1 mL移液管引入的相对标准不确定度为：

其他玻璃量器的相对标准不确定度计算见表2。

表2 玻璃量器引入的相对标准不确定度

由玻璃量器引入的不确定度为：

综上，标准溶液配制过程的引入不确定度为：

2.3.2 标准曲线拟合引入的不确定度urel(curve)

由实验得到的标准曲线方程为：y=33 207.7x-5 046.0，r=0.998 6（n=5），则有a=-5 046.0，b=33 207.7。

式中：X-样品测量的平均浓度，1.05 ng/mL；P-样品测量的次数，p=2；n-标准曲线浓度点，n=5；-标准曲线平均浓度，3.70 ng/mL；xi-标准曲线各浓度点，ng/mL；yi-标准曲线各浓度点的峰面积；yi′-拟合曲线计算的峰面积。

将表3中的参数代入式（2）（3），得到：SA=7 914.53，urel(curve)=0.058 1

表3 拟合曲线相关值

2.3.3 样品称量引入的不确定度u(m)

称取试样质量为5.000 0g，电子分析天平的最大允差为±0.000 1 g，按矩形分布k=计算，样品称量过程引入的相对标准不确定度为：

2.3.4 样品前处理引入的不确定度u(c)

本实验方法的提取过程涉及到溶剂定量提取和定量浓缩，所以样品处理过程引入不确定度的主要来源为3 mL、10 mL和50 mL移液管；1 mL和20 mL量瓶。

（1）移液管引入的不确定度。根据JJG196—2006常用玻璃量器可知最大允差，具体见表4。

表4 移液管引入的相对标准不确定度

假设分布类型为三角分布，可计算出由3 mL移液管引入的相对标准不确定度为：

以此类推，其他移液管的相对标准不确定度计算结果见表4，可得由移液管引入的不确定度为：

（2）量瓶引入的不确定度。根据JJG 196—2006常用玻璃量器可知最大允差，具体见表5。

表5 量瓶引入的相对标准不确定度

假设分布类型为三角分布，可计算出由1 mL量瓶引入的相对标准不确定度为：

以此类推，其他量瓶的相对标准不确定度计算结果见表5，可得由移液管引入的不确定度为：

综上，样品前处理引入的不确定度为：

3 标准不确定度的合成与拓展

3.1 合成相对标准不确定度

综合各分量可得合成相对标准不确定度为：

3.2 合成标准不确定度U(X)

肉豆蔻中玉米赤霉烯酮的含量为6.8 μg/kg，相对合成标准不确定度为：

3.3 扩展不确定度U

扩展不确定度U取置信概率为95%，包含因子k=2，则肉豆蔻中玉米赤霉烯酮的扩展不确定度为：

试样中玉米赤霉烯酮的测量结果为：

4 结论

通过整个分析过程可知，本次实验中不确定度的最大影响因素为标准溶液的配制及拟合过程，而其他分量引入的不确定度均影响较小。为避免不确定度增大，可选择资质较齐全、标准不确定度较低的标准物质，配制标准曲线时应使用已校正的A类玻璃量器，也可增加标准曲线的重复测定次数。另外，也要加强操作人员的培训，提高实验技能熟练度，将人为误差降至最低。