饲养密度和硫辛酸对肉鸡血清指标、行为及骨骼发育的影响

2021-02-07李文嘉马慧慧魏凤仙王琳燚王改利孙全友李绍钰

动物营养学报 2021年1期

李文嘉徐彬马慧慧魏凤仙王琳燚付趁王改利孙全友李绍钰

(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州450002)

近年来，为了追求高生产效率，节约成本，满足市场不同需求，肉鸡生产逐渐呈现出集约化、快速化、高饲养密度的特点。在集约化、规模化养殖模式下，家禽的生存环境恶劣，使其长期处于应激状态，严重破坏了家禽的健康。然而，当今社会，食品安全和肉品质日益受到重视，养殖动物所处的生产过程也受到密切关注。因此，肉鸡养殖业中饲养密度过高给肉鸡健康生产造成的负面影响亦越来越突显。研究表明，当饲养密度超过30 kg/m2时，肉鸡釆食减少，同时脚垫损伤和皮肤擦伤的发生率增加[1]。当饲养密度超过35 kg/m2(0.052 m2/只)时，肉鸡体重显著下降[2]，Ericsson等[3]认为其原因是密度过大影响肉鸡采食，导致营养素摄入不足所致。在前期研究中我们也发现，当饲养密度达到0.056 m2/只(18只/m2)时，肉鸡生长、饲料效率以及免疫性能均显著低于常规饲养密度组(15只/m2)[4]。田允波[5]研究发现，饲养密度过大不利于肉鸡体热的散发，且高饲养密度条件下，鸡群在夏季和秋季猝死率显著升高[6]。与此同时，饲养密度可直接影响鸡只的活动空间，而肉鸡的行为与其活动空间大小密切相关。

Van Reenen等[7]研究指出动物行为可反映出其生存环境的舒适程度。当动物机体处于舒适的环境中，会表现出正常的生理行为，当所处环境福利变差，动物则会出现异常行为。因此，肉鸡的行为是评价肉鸡健康和福利状态的可靠指标。在企业生产过程中，往往采用高密度、集约化的生产方式，通过把养殖动物限制起来，长时间进行采食行为，导致生存环境恶劣，正常遗传行为得不到满足，生理应激压力随之而生，就会表现出行为异常。随着饲养密度的增加，肉鸡的运动越来越少，很少进行抓、刨和走动、打闹等活动。因此，我们推测，高饲养密度会影响肉鸡的正常行为，从而引发其腿部疾病，甚至会导致骨骼发育畸形。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,LA)是一种良好的抗氧化剂，其主要功能是作为线粒体中氧化磷酸化过程中多酶复合物的辅因子，在机体线粒体能量代谢中起着重要作用[8]。同时，LA可以与活性氧结合达到淬灭自由基的效果，也可以与金属离子进行螯合，阻止体内自由基的形成[9]，还可以使得一些内源性抗氧化剂(维生素C、维生素E、谷胱甘肽等)再生[10]。但是，有关LA对于肉鸡饲养密度和骨骼发育方面作用的研究较少。因此，本试验拟设定不同的饲养密度，并在高饲养密度条件下补饲LA，通过对肉鸡生理应激、行为学和骨骼发育等指标进行分析，探讨饲养密度和LA对肉鸡生理应激、行为和骨骼发育的影响，为确定集约化肉鸡饲养密度提供理论依据，为肉鸡实现健康养殖的可持续发展提供保障。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验选取1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡3 000只，由开封禾丰牧业有限公司提供，按养殖流程正常投喂饲养。并于21日龄时从中挑取健康状况良好、体重相近的肉仔鸡1 530只，随机分成3个组，对照组为常规饲养密度组(ND组，15只/m2，饲喂基础饲粮)，试验组为高饲养密度组(HD组，18只/m2，饲喂基础饲粮)和高饲养密度+LA组(HD+LA组，18只/m2，在基础饲粮在添加300 mg/kg LA)，每组6个重复，ND、HD和HD+LA组每个重复肉仔鸡数目分别为75、90和90只，试验期为3周。采用网上平养方式，以重复为单位养殖在长2.46 m、宽2.02 m、高0.60 m的养殖笼内，各重复之间用塑料网隔开。

基础饲粮采用玉米-豆粕型饲粮，参照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)肉仔鸡营养需求配制，其组成及营养水平见表1。饲养试验在河南农科院尉氏养殖基地进行。

1.2 饲养管理

养殖试验采用网上平养，舍饲颗粒料的方式进行。试验期间肉仔鸡自由采食、饮水，采用23 h人工光照、1 h黑暗处理。按照正常商业饲养管理方式进行常规免疫，保持鸡舍良好通风，试验过程中每天观察试验鸡只状况，记录鸡群生长和死亡情况，一旦发现有死亡鸡只，及时处理并补充体重相近的肉鸡。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

续表1项目 Items日龄 Days of age1～2122～42 有效磷 AP0.460.41赖氨酸 Lys1.151.00蛋氨酸 Met0.520.42蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.850.77苏氨酸 Thr0.880.81色氨酸 Try0.290.27

1.3 测定指标与方法

1.3.1 血清钙、磷含量及应激指标测定

于42日龄禁食12 h后，每各重复随机取2只鸡，采用翅静脉采血，3 000 r/min离心15 min，制备血清，分装后于-80 ℃中保存。测定血清中钙、磷、甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)和皮质酮(corticosterone,CORT)含量以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、还原型辅酶Ⅱ氧化酶(NADPH-oxidase,NOX)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)、单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性。上述指标均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，测定步骤严格按照说明书进行。

1.3.2 行为学指标测定

采用目标取样法[11]，每个重复随机用生物染料标记4只目标鸡，于试验最后3 d使用摄像机对目标鸡只连续拍摄4 h。将储存视频用行为观察分析系统(Observer XT,Noldus，荷兰)对目标鸡的活动行为(采食、饮水、站立、走动等)和休息行为(休息、趴卧、伸展等)主要行为进行分析，统计每只目标鸡各行为发生的频次和比例。数据记录整个过程中仅1人观察，每次观察各组中的1个重复，统计完后再进行下一个重复。行为频次定义为单位时间内所发生该行为的次数。行为时间占比定义为该行为发生时间占总行为发生时间的百分比。参照厉秀梅等[12]和朱晓彤等[13]的报道将肉鸡行为类别进行分类和定义，具体见表2。

表2 肉鸡行为类别及其定义

1.3.3 骨骼发育指标测定

将42日龄采集静脉血后的鸡只屠宰，取左侧胫骨、股骨，测定质量、长度、直径、密度、强度以及矿物盐、钙、磷、灰分含量，并计算骨体比(bone weight rate,BWR)。小心剔除骨上的软骨、脂肪、肌肉组织等附着物，测定胫骨鲜重，计算骨体比。用游标卡尺测量长度和直径。采用灰化法(GB/T 6438—2007)测定骨灰分含量，乙二胺四乙酸二钠络合滴定法(GB/T 6436—2002)测定骨钙含量，分光光度法(GB/T 6437—2002)测定骨磷含量。采用三点弯曲试验(TMS-Pro,Food Texture Analyzer,FTC,美国)检测骨强度。骨密度和矿物盐含量采用定量计算机断层扫描仪(Model 922010,Norland Medical Systems Inc.,美国)测定。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间存在显著差异时，再进行Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05作为检验各项数据显著性的标准。数据以“平均值±标准误”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 饲养密度和LA对肉鸡血清钙、磷含量和应激指标的影响

由表3可知，各组间血清磷、PTH含量以及XO和MAO活性差异不显著(P>0.05)。HD组血清钙含量和ALP活性与ND组相比显著下降(P<0.05)，而HD+LA组血清钙含量和ALP活性与HD组相比显著上升(P<0.05)。HD组血清CORT含量以及NOX和MPO活性显著高于ND组(P<0.05)。与HD组相比，HD+LA组血清CORT含量以及NOX和MPO活性显著降低(P<0.05)，血清XO和MAO活性虽有下降的趋势，但差异不显著(P>0.05)。

表3 饲养密度和LA对肉鸡血清钙、磷含量及应激指标的影响

2.2 饲养密度和LA对肉鸡行为的影响

由表4可知，各组间站立和伸展频次差异不显著(P>0.05)。相较于ND组，HD组的行走、梳翅、采食频次显著降低(P<0.05)，而饮水频次显著升高(P<0.05)。与HD组相比，HD+LA组采食频次显著升高(P<0.05)，饮水频次显著降低(P<0.05)，梳翅频次有所上升，但差异不显著(P>0.05)。

表4 饲养密度和LA对肉鸡行为频次的影响

由表5可知，各组间站立和伸展时间占比差异不显著(P>0.05)。相较于ND组，HD组行走、梳翅、采食时间占比显著降低(P<0.05)，而饮水和趴卧时间占比显著升高(P<0.05)。与HD组相比，HD+LA组采食时间占比显著升高(P<0.05)，趴卧时间占比显著下降(P<0.05)，行走、梳翅和饮水时间占比也有所改变，但差异不显著(P>0.05)。

表5 饲养密度和LA对肉鸡行为时间占比的影响

2.3 饲养密度和LA对肉鸡骨骼发育的影响

由表6可知，与ND组相比，HD组胫骨直径、质量、骨体比、密度、强度以及钙、磷、灰分和矿物盐含量均显著降低(P<0.05)，仅胫骨长度无显著变化(P>0.05)。与HD组相比，HD+LA组胫骨质量以及钙、磷含量显著升高(P<0.05)，胫骨密度、骨体比以及矿物盐和灰分含量有上升趋势，但差异不显著(P>0.05)。

表6 饲养密度和LA对肉鸡胫骨发育指标的影响

由表7可知，与ND组相比，HD组股骨直径、质量、密度、强度以及钙、灰分和矿物盐含量显著降低(P<0.05)，股骨磷含量、长度和骨体比无显著变化(P>0.05)。与HD组相比，HD+LA组股骨密度、强度和钙含量显著升高(P<0.05)，股骨直径、质量以及灰分和矿物盐含量有上升趋势，但差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

3.1 饲养密度和LA对肉鸡血清指标的影响

饲养密度一直是畜牧业关注的焦点。企业为了追求高生产效率和经济效益，迫使肉鸡饲养密度越来越高。纵然高密度饲养提高了肉鸡的产量，但对鸡肉品质、疾病发生率等方面造成了许多负面效应，影响了鸡群健康，导致经济效益下降。在本实验室前期研究中显示，高饲养密度会导致肉鸡生长性能下降，这可能是由于室内养殖环境易受集约化养殖程度的影响，高密度饲养会限制空气流通，增加空气中氨的浓度，降低肉鸡体热的正常散失[4]。此外，研究还发现高饲养密度组肉鸡平均日摄食率也显著下降[4]，并推测相较于低饲养密度，在高饲养密度下生长的肉鸡更容易出现相互推搡和腿疾，导致肉鸡移动困难，摄食率降低[14]。

表7 饲养密度和LA对肉鸡股骨发育指标的影响

众所周知，ALP是成骨细胞成熟的标志酶，是骨形成过程中必要的催化剂，在骨骼钙化和形成过程中起关键作用[20]。本试验发现，与常规饲养密度相比，高饲养密度显著降低了血清ALP活性，推测肉鸡在高饲养密度条件下，相对活动空间狭小、活动受限等因素促使肉鸡发生应激，这可能导致其成骨细胞的活性比例下降，进而影响了骨骼的钙磷代谢及发育[21]。这与表3中血清钙含量以及表8中股骨矿物盐、钙、磷、灰分含量在HD组显著下降相吻合。然而，目前有关饲养密度对家禽血清ALP活性影响的研究较少，确切的影响及其机制有待于进一步研究。

在本实验室前期的研究中，我们发现高饲养密度对肉鸡血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量有显著影响[4]。在本试验中，随着饲养密度的增加，血清CORT含量呈现升高趋势，这可能是由于高饲养密度会加剧热应激(尤其在夏季)的影响，抑制肉鸡蒸发散热，应激强度增强，从而导致血清中CORT含量升高，这与本实验室之前的研究结论相符合。袁建敏[22]指出，CORT是应激敏感指标，提高饲养密度容易引起肉鸡发生应激，引起CORT等血液指标的改变。然而，秦鑫等[23]研究指出，饲养密度对肉鸡血清CORT含量没有显著影响。造成这种差异的原因可能是由于秦鑫等[23]研究中所设定的饲养密度(10、14只/m2)较低所致。由本试验数据可知，HD+LA组血清CORT含量相较于HD组显著降低，这说明在肉鸡饲粮中添加LA可以在一定程度上缓解由于饲养密度过高引发的应激反应。

MPO在动物体内可利用过氧化氢和氯离子，产生次氯酸[24]，在细胞内炎症反应和氧化应激中起到决定性作用[25]。本试验结果发现，HD组血清MPO活性显著高于ND组和HD+LA组，这说明高饲养密度会使肉鸡发生氧化应激，进而使血清MPO活性升高。同时，有研究指出，当MPO与未激活的MPO集合到甘露糖受体上，使受体与配体之间相互作用，启动呼吸爆发，可加快氧气消耗速度，同时激活膜结合的NOX[26]。这也与本试验中血清NOX活性在HD组较高的结果相一致。因此，推测LA可通过提高抗氧化性能和抑制氧化性能维持氧化还原状态的稳定，减轻由高饲养密度所造成的氧化应激，进而抑制体内MPO活性的升高。

3.2 饲养密度和LA对肉鸡行为的影响

动物的行为是由先天遗传和后天环境影响复合所形成的，是动物个体与其所处的有机或无机环境维持动态平衡所必需的手段[27]。集约化高密度生产过程中把动物限制在一个较小的活动范围内，生存环境比较恶劣，正常行为得不到满足，这种限制动物表达自身天性自由的外界环境刺激会导致其表现出异常行为，影响畜禽体质健康。许多研究指出，行为学是判断畜禽疾病发生与否的可靠标准[6,28-29]。因此，肉鸡行为的变化是评价肉鸡健康和福利状态的有效指标[30]。本试验研究结果显示，相较于常规饲养密度，高饲养密度条件下肉鸡的行走、梳翅、采食频次和时间占比显著降低。这可能是由于肉鸡在高饲养密度条件下活动空间受限，福利水平降低，其行走和梳翅行为受到明显的空间限制所致。张增玉等[31]在对不同饲养密度条件下肉鸡行为的研究中发现，随着饲养密度的增加，肉鸡的运动越来越少，很少进行抓、走动、打扮等活动。Buijs等[32]研究指出，增加饲养密度会提高鸡群的恐惧性，导致其活动频率和频次降低。也有研究发现，增加饲养密度会影响肉鸡羽毛梳理，造成羽毛评分变差[33]。此外，Ventura等[34]和Simitzis等[35]研究发现，饲养密度的增加会导致鸡群采食行为下降，降低栖息性，提高蹲卧活动，这与本试验中高饲养密度使得肉鸡采食频次显著下降以及趴卧时间占比显著上升的结果相一致。

许多研究指出，高饲养密度不利于肉鸡体热的散发，且饲养密度为18只/m2时，鸡群在夏秋季猝死率显著升高[5-6]。这可能是由于高饲养密度环境下诱发肉鸡偏热应激，肉鸡可能采取减少采食和活动来降低自身代谢，并通过增加饮水来缓解高饲养密度带来的应激，这与本试验中高饲养密度环境下肉鸡饮水频次和时间占比显著升高的结果相吻合。Mack等[36]和胡春红等[37]分别对蛋鸡和肉鸡进行研究发现，偏热环境导致蛋鸡、肉鸡俯卧休息时间显著增多。

本试验结果显示，高饲养密度条件下，饲粮中添加LA对肉鸡行走、采食、饮水、梳翅和趴卧等行为有不同程度的改善。然而，就目前研究现状来看，有关LA对肉鸡行为福利方面影响的研究比较罕见。在本实验室前期的研究中发现高饲养密度会增加肉鸡的热应激，造成其生长、免疫及抗氧化性能下降[4]，而LA的添加可以提高肉鸡机体的抗氧化机能，降低体内自由基对细胞膜的损伤，维持细胞膜功能，进而缓解高温造成的应激[38]。因此，在饲粮中添加LA可有效降低高饲养密度介导的热应激，对肉鸡的行为福利也有一定程度的改善作用。

3.3 饲养密度和LA对肉鸡骨骼发育的影响

骨的密度、质量、强度以及灰分和钙、磷含量等是评价肉鸡骨骼发育及其强度变化的重要指标[21]。倪可德[39]指出，骨重占体重的相对比例(骨体比)是反映幼禽钙、磷需要的敏感指标，是反映骨骼发育状况的指标之一，其比例高，说明钙、磷的需求满足程度高，骨骼的发育较好。本试验结果显示，高饲养密度对肉鸡骨骼(胫骨和股骨)质量、密度、骨体比、以及钙、磷、灰分、矿物盐含量等指标均有不同程度的负面影响。有文献指出，在高饲养密度条件下，家禽腿部健康易受影响[40]，胫骨软骨发育不良情况发生率随饲养密度的增加而增大[41]。Sun等[42]和张璐爽等[43]分别对肉鸡和北京鸭进行了研究，结果显示，高饲养密度会导致胫骨灰分、钙、磷含量降低；厉秀梅等[12]对肉鸡的研究发现，高饲养密度组(18.75只/m2)的胫骨长度和质量显著低于中、常规饲养密度组。本试验结果与以上研究结果相符合。

由前文可知，随着饲养密度的增加，肉鸡体内氧化应激越发明显。有文献指出，应激过程中产生的自由基会刺激破骨细胞的分化作用，并诱导破骨细胞再次分泌自由基参与骨的再吸收过程，加剧骨基质的降解[49-50]；并且，氧化应激还会抑制成骨细胞的分化和增殖，影响骨基质的形成[51]，这与本试验中高饲养密度下肉鸡骨骼发育异常的结果相一致。白水莉[52]通过试验得出，高饲养密度和环境应激对肉鸡骨骼发育的影响很大，特别是在商业集约化养殖生产中。在本研究中，在高饲养密度肉鸡饲粮中添加LA有效改善了肉鸡骨骼发育的状况。这可能是由于LA是一种抗氧化剂，对肉鸡机体抗应激，特别是自由基的清除起到重要作用，同LA在三羧酸循环和三大营养物质代谢中也发挥重要作用，它能够提高骨骼肌细胞对葡萄糖的摄入能力，增强机体细胞内线粒体的生物学功能。有文献指出，LA能有效改善由氧化应激导致的骨组织内核因子-κB(NF-κB)配体受体致活剂(RANKL)的激活、护骨素(OPG)的抑制以及NF-κB和白细胞介素-6(IL-6)表达的增高，显著缓解了骨质疏松的程度[53]。朱琳玲[54]研究发现，LA的添加可显著恢复由高脂饲粮引起的小鼠应激所导致的股骨长度、直径和羟脯氨酸含量异常现象。由此说明，高饲养密度环境应激下肉鸡骨代谢发生紊乱，影响胫骨和股骨的发育，饲粮中添加LA后能有效改善饲养密度应激对肉鸡造成的损伤。