p300在老年小鼠心房颤动易感性中的作用研究

彭德威，周慧珊，刘海燕，高小燕，赖颖瑜,3，李巧巧，邓春玉，杨 慧，邝素娟，薛玉梅，吴书林，饶 芳

(1.华南理工大学医学院，广东 广州 510006；2.广东省心血管病研究所心内科，广东省人民医院医学研究部，广东省医学科学院，广东 广州 510080；3.南方医科大学药学院，广东 广州 510515)

房颤(atrial fibrillation，AF)是临床最常见的心律失常之一，可导致中风和心力衰竭等并发症，严重影响患者的生存[1-2]。衰老是房颤的独立危险因素，房颤发病率随着年龄的增长而增加[3]。在60-65岁的人群中发生房颤的比例不到1%，而80岁以上人群则高达8%-10%[4]。但衰老在房颤发病机制中的作用尚未阐明。

心房肌细胞电重塑是房颤的主要病理机制之一，其主要标志是心房有效不应期缩短，频率适应性丧失和心房传导延长。心房肌细胞钙蓄积，使内向L型钙电流(L-type calcium channel current，ICa,L)减少，导致心房有效不应期缩短和多子波-折返通路形成和维持，进而导致房颤的发生和发展。研究发现，衰老心脏的心房肌细胞ICa,L减少，心房有效不应期缩短，并出现心肌肥大和凋亡，心房纤维化等病理改变，房颤易感性增加[5]。但目前关于衰老导致房颤的具体分子机制研究较少。

转录辅激活因子p300是细胞信号转导的桥梁，参与调控细胞周期、分化和凋亡[6]。研究表明，在人肺成纤维细胞中，p300是复制性衰老表型的主要驱动力，抑制p300可延缓复制性衰老的进程[7]。在小鼠心衰模型中，p300通过乙酰化Ca2+-ATP酶SERCA2a并抑制其功能，引起细胞内钙离子稳态失衡从而导致心肌功能障碍[8]。但p300是否通过调控ICa,L，在衰老相关心房肌细胞电重塑中发挥重要作用，目前尚无相关研究报道。本研究旨在探讨p300在调控老年心房肌细胞电重塑中的作用，为临床上衰老相关房颤的防治提供新策略。

1 材料

1.1 动物由广东省广州中医药大学实验动物中心提供的SPF级C57BL/6雄性小鼠，分别是5、13和18月龄，许可证号为SCXK(粤)2013-0034。部分18月龄小鼠随机分组，分别给予低剂量(50 mg·kg-1·d-1，n=10)和高剂量(100 mg·kg-1·d-1，n=10)的姜黄素饲养。本研究所有的动物实验已通过广东省人民医院(广东省医学科学院)动物实验伦理审查(No GDREC2016128A)。

1.2 主要试剂与仪器抗p300抗体(Millipore)；抗Cav1.2抗体(Alomone)；抗p53抗体(Cell Signaling Technology)；抗p21抗体(Santa Cruz)；GAPDH抗体 (Cell Signaling Technology)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Invitrogen)；硝酸纤维素膜PVDF膜(Millipore)；Langendorff 恒流灌流装置；姜黄素(Cayman)；4×蛋白上样缓冲液(Bio-RAD)；RIPA裂解液(Beyotime)。实验设备包括恒温水循环灌流装置(Narishige,Japan)，P97拉制仪(Sutter,America)，MultiClamp 700B膜片钳放大器及附件(Axon,America)。

2 方法

2.1 小鼠心房快速起搏称取小鼠体质量，腹腔注射3%(30 mg·kg-1)戊巴比妥钠。将小鼠仰位固定于实验台上，使用小动物温控加热垫监测温度并将其保持在(37-38) ℃之间。备皮、局部消毒。将铂金针刺电极连接到小鼠的四肢，使用iWorx数据采集和分析系统对小鼠心电图进行记录和分析，连续记录Ⅰ和Ⅱ导联心电图。颈部正中切口，钝性分离右侧颈静脉，结扎远心端。血管中段穿过两根手术线备用，血管夹夹闭近心端。在右侧颈静脉作小切口，置入鞘管，固定近心端。在心腔内心电图和体表心电图监测下沿鞘管送入电极导管，松开近心端血管夹，将心电导管送入右心房。

以1 ms的起搏脉宽，比基础心率快10 beat·min-1的起搏频率进行起搏阈值测定。以心腔内心电图出现高大A波小V波为理想的记录图。电极导管放置到位，以确保获得恒定的心房夺获并达到最小起搏阈值，固定电极导管。采用心房爆发式起搏(Burst)模式，设置刺激幅度为2倍的起搏阈值，刺激脉宽为1 ms，进行15 s的起搏，实验重复10次。观察并记录AF的持续时间和发作次数。AF定义为心房无序的电活动，心电图表现为P波消失，代之以大小不等间隔不均，形态不一的f波，RR间期不等，持续1 s以上。AF诱发率定义为成功诱发AF的次数与总诱发次数的比值。AF持续时间定义为每只小鼠自AF诱发起始到AF自然终止之间的时距。

2.2 全细胞膜片钳记录使用Langendorff恒流灌流装置分离小鼠单个心房肌细胞，6 h之内用于电生理实验。记录ICa,L的细胞外液成分(mmol·L-1)：CsCl 100,TEA-Cl 20,Na2-ATP 5,Na2GTP 0.4,EGTA 10，HEPES 10,用Tris将pH调至7.2。记录ICa,L的细胞内液成分(mmol·L-1)：Choline-Cl 126，CsCl 5.4,MgCl2·6H2O 1,NaH2PO4·2H2O 0.33,Glucose·H2O 10,HEPES 10,CaCl2·2H2O 2，用CsOH将pH调至7.4。记录AP的细胞外液成分(mmol·L-1)：NaCl 136,KCl 5.4,MgCl2·6H2O 1,D-glucose 10,HEPES 10,CaCl2·2H2O 1.8，NaH2PO4·2H2O 0.33，用NaOH将pH调至7.4。记录AP的电极内液成分(mmol·L-1)：KCl 140,MgCl2·6H2O 1,HEPES 10,EGTA 5 and Na2-ATP 5，KOH使pH调至7.2。

采用两步法拉制玻璃电极，灌注电极内液后排出气泡，置于推进器上，控制电极尖端电阻为(2-5) MΩ。高阻封接(阻抗>1 GΩ)后，予负压破膜形成稳定的全细胞状态，电容及电阻补偿后，形成全细胞记录。使用Digidata 1 440 A低噪声数据采集系统，通过MultiClamp 700B(Axon公司，美国)放大器记录信号。使用电压钳模式测量并记录ICa,L和膜电容(membrane capacitance，Cm)，电流钳模式测量并记录AP。使用pCLAMP 10.5软件控制命令电位和数据采集。使用Clampfit 10.4软件对单个全细胞记录进行数据测量。在形成全细胞状态后，将细胞钳制在-40 mV，紧接着施于从-50-+50 mV，步阶电压为10 mV，波宽为300 ms，频率为0.2 Hz的刺激，记录ICa,L。以峰电流(pA/pF)对膜电位作图，即得I-V曲线。

3 结果

3.1 不同月龄小鼠心房组织p300、离子通道和衰老相关蛋白的表达收集不同月龄(5、13和18月龄)C57BL/6小鼠左心耳组织，Western blot检测组织中p300，L型钙离子通道Cav1.2，衰老相关蛋白p53和p21的表达。结果显示，与5月龄小鼠相比，13月龄和18月龄小鼠左心耳p300表达增加(0.73±0.18 in 5月龄vs1.14±0.23 in 13月龄，1.07±0.18 in 18月龄,P<0.01,n=6)，Cav1.2表达减少(1.02±0.30 in 5月龄vs0.74±0.20 in 13月龄,P<0.05；0.58±0.08 in 18月龄,P<0.01,n=6)，衰老相关蛋白p53和p21明显增加(p53：0.53±0.17 in 5月龄vs0.94±0.14 in 13月龄，P<0.01；0.72±0.22 in 18月龄,P<0.05；p21:0.56±0.16 in 5月龄vs1.06±0.23 in 13月龄,P<0.01；0.98±0.21 in 18月龄,P<0.01,n=6)。提示13月龄和18月龄小鼠左心耳组织p300表达明显增加，衰老相关蛋白表达增加，而L型钙通道蛋白表达减少(Fig 1)。

Fig 1 The protein expression of p300,Cav1.2,p53 and p21 in atrial tissues of C57BL/6 mice at different ages (,n=6).*P<0.05,**P<0.01 vs 5 m group.

3.2 不同月龄小鼠心房肌细胞ICa,L和APD体外分别分离5月龄和18月龄C57BL/6小鼠左心耳单个心房肌细胞，膜片钳技术检测心房肌细胞ICa,L和动作电位时程(action potential duration，APD)。结果显示，与5月龄的小鼠相比，18月龄小鼠左心耳心房肌细胞ICa,L的峰值电流密度明显减少(在峰值电压+10 mV时，分别是(-1.84±0.42) pA/pFvs(-1.16±0.32) pA/pF，P<0.01，n=10-11)(Fig 2A、2B)，APD90(78.04±16.52 msvs38.28±5.56 ms)、APD70(44.2±11.77 msvs23.19±5.77 ms)、APD50(23.90±6.78 msvs14.22±5.08 ms)均明显缩短(P<0.01，n=9-10)(见Fig 2C)，动作电位幅度(action potential amplitude,APA)无统计学意义(P>0.05)。

3.3 不同月龄小鼠快速心房起搏刺激房性心律失常的可诱发性5月龄和18月龄C57BL/6小鼠分别予经颈静脉心房快速起搏，观察房性心律失常的可诱发性。与5月龄小鼠相比，15 s心房爆发式起搏后18月龄小鼠的AF诱发率明显升高(4%vs14.3%，P<0.01)(Fig 3B)。

3.4 姜黄素处理可降低老年组小鼠房颤可诱发性以不同剂量姜黄素(50、100 mg·kg-1·d-1，6个月)饲养小鼠至18月龄，予以经颈静脉心房快速起搏，观察姜黄素对老年小鼠AF可诱发性的影响。结果发现，与18月龄小鼠相比，不同剂量的姜黄素处理均可使18月龄小鼠的AF诱发率降低(18月龄组vs低剂量组，14.3%vs1.36%,P<0.01；高剂量组为1.19%，P<0.01)(Fig 3B)。

3.5 姜黄素处理老年组小鼠可逆转其心房电重塑分离对照组和不同剂量姜黄素处理的18月龄小鼠的左心耳单个心房肌细胞，膜片钳技术检测相应的ICa,L和APD。结果显示，姜黄素可使老年组小鼠心房肌细胞降低的峰值电流密度明显恢复(在峰值电压+10 mV时，18月龄组vs低剂量组,(-1.16±0.32) pA/pFvs(-2.04±0.42) pA/pF，P<0.01；高剂量组为(-1.54±0.37) pA/pF，P<0.01,n=10-13)(Fig 4A、4B)。且与对照组相比，低剂量姜黄素处理组小鼠左心耳细胞APD90(38.28±5.56 msvs64.53±17.28 ms，P<0.01)、APD70(23.19±5.77 msvs37.29±10.52 ms，P<0.01)、APD50(14.22±5.08 msvs20.76±6.71 ms，P<0.05)延长(n=9-10)(Fig 4C)，动作电位幅度(action potential amplitude，APA)差异无统计学意义(P>0.05)。提示姜黄素能改善老年小鼠心房肌细胞的电重塑。

Fig 2 ICa,L and APD in 5 m and 18 m C57BL/6 mice groups()A:Representative traces of ICa,L and corresponding current-voltage relationships in atrial myocytes from 5 m and 18 m C57BL/6 mice [n=10-11/3-4(atrial myocytes/mice)]；B:Voltage dependence activation,inactivation and time course of recovery for ICa,L in above groups[n=10-20/3-4 (atrial myocytes/mice)]；C:Representative traces of APD in atrial myocytes in above groups [n=9-10/3-4(atrial myocytes/mice)].APA,APD90,APD70,APD50were calculated.**P<0.01 vs 5 m group.

Fig 3 AF incidence induced by rapid atrial pacing in 5 m,18 m mice with or without curcumin treatmentA：Typical surface ECG and intra-atrial electrocardiogram (IAEG)；B：AF incidence in 5-month old，18-month old with or without curcumin treated mice(n=10/8/8/9,respectively).**P<0.01 vs 5-month-old mice;##P<0.01 vs 18-month-old mice.(C) Typical surface ECG recordings in mice with AF that spontaneously reverted to SR.(D) Disorganized atrial wave (f wave).

Fig 4 ICa,L and APD in 18 m C57BL/6 mice with or without curcumin treatment()A:Representative traces of ICa,L and corresponding current-voltage relationships in atrial myocytes [n=10-13/3-4 (atrial myocytes/mice)]；B:Voltage dependence activation,inactivation and time course of recovery for ICa,L [n=10-21/3-4 (atrial myocytes/mice)]；C:Representative traces of APD in atrial myocytes [n=9-10/3-4 (atrial myocytes/mice)].APA,APD90,APD70,APD50 were calculated.*P<0.05,**P<0.01 vs 18 m group,##P<0.01 vs high curcumin group.APA:action potential amplitude.

4 讨论

本研究中，我们主要发现：(1)与年轻组相比，老年小鼠左心耳组织中p300和衰老信号通路p53/p21表达明显增加，而钙通道蛋白Cav1.2表达明显减少。左心房心肌细胞发生电重塑，表现为ICa,L明显降低和APD明显缩短。老年小鼠房颤的可诱发性明显增加。(2) p300抑制剂-姜黄素干预后，可使老年小鼠心房肌细胞的电重塑明显改善，APD延长，并可明显降低老年小鼠的房颤可诱发性。

细胞衰老是指增殖中的细胞，细胞周期停在G1期，是对应激的一种反应；主要表现为细胞变得肥大，端粒酶缩短，衰老相关蛋白p53、p21表达增加，衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype)表达增加[9]。既往研究认为心肌细胞作为终末细胞，不会发生增殖，但是近年来的研究表明，心肌细胞可以缓慢增殖，并可通过干细胞进行部分更新，亦可出现衰老[10]；多种心血管疾病如动脉粥样硬化、心力衰竭和AF都与衰老密切相关[3]。有研究表明，老年小鼠心脏线粒体比年轻小鼠产生更多的ROS，机体内氧化还原平衡能力下降，AF易感性增加[11]。衰老心肌中肌浆网钙含量减少以及钙瞬变幅度降低，Ca2+-ATP酶(SERCa2a)表达减少[5,12]。此外，衰老心脏中，成纤维细胞增生替代丢失的心肌细胞，参与衰老相关结构重塑[13]。然而，目前关于衰老对心房肌细胞电重塑影响的机制研究尚不明确。

转录辅激活因子p300是一种细胞内普遍存在的核磷酸蛋白，具有组蛋白乙酰转移酶活性，在细胞增殖、凋亡和胚胎发育中起重要作用[6,14-15]。研究发现，p300纯合突变小鼠发育迟缓，出现较高的早期胚胎死亡率。与野生型胚胎细胞相比，p300-/-突变型心脏组织中肌球蛋白重链(MHC)和α-肌动蛋白表达显著减少，并伴有心包积液等致命心血管疾病的风险[16]。研究还表明，p300参与细胞衰老的调控，p300通过乙酰化来调节p53的活性，进而参与生长抑制因子2(inhibitor of growth protein 2)诱导的复制性衰老[17]。在人肺成纤维细胞中p300的耗竭可以延缓细胞的衰老，p300过表达明显抑制细胞的增殖[7]。另外，研究表明，在心衰患者中，p300参与心肌细胞内钙离子的调控。且在小鼠心衰模型中，p300表达明显增加，并通过乙酰化SERCA2a抑制其功能，引起细胞内钙离子稳态失衡和心肌功能障碍[8]。本研究中，我们发现与年轻组小鼠相比，老年小鼠心房组织的p300表达明显增加，衰老信号通路激活，同时出现L型钙通道蛋白Cav1.2的表达降低，心房肌细胞出现电重塑。而给予姜黄素干预，可逆转上述变化，提示p300可能参与心房肌细胞电重塑的病理过程。既往研究表明，姜黄素具有双向剂量反应，低剂量姜黄素具有明显的抗炎、抗衰老作用，高浓度姜黄素反而促进细胞衰老[18]。在本研究亦发现，两种不同剂量的姜黄素都能延长老龄小鼠心房肌细胞ICa,L，低剂量组优于高剂量组，提示低剂量的姜黄素可能可以更好的改善衰老所致心房电重塑。姜黄素可减少快速心房起搏诱导老年小鼠的房颤发生率，提示拮抗p300可能是潜在的衰老导致房颤的治疗靶点。

因此，本研究证实了p300在衰老相关心房肌电重塑中发挥重要作用，其表达增加可导致心房组织衰老信号通路的激活，以及心房肌细胞的电重塑，最终发生房颤。