3种抗生素处理对灰茶尺蛾内生菌群的影响

王志博，白家赫，周孝贵，郭华伟，肖强

3种抗生素处理对灰茶尺蛾内生菌群的影响

王志博，白家赫，周孝贵，郭华伟，肖强*

中国农业科学院茶叶研究所，农业农村部茶叶质量安全控制重点实验室，浙江 杭州 310008

为明确不同抗生素对灰茶尺蛾内共生菌群落的影响，分别选用质量浓度2.5 mg·mL-1的四环素、头孢氨苄、利福平3种抗生素溶液浸泡新鲜茶树叶片持续饲喂灰茶尺蛾幼虫3代，通过16 S rDNA高通量测序技术对内生菌群群落变化展开研究，并进一步基于基因分子标记对灰茶尺蛾沃尔巴克氏体菌去除效果进行检测。结果表明，3种抗生素处理后，灰茶尺蛾菌群落均表现为丰富度增加、多样性减小；四环素和利福平饲喂处理能够成功将灰茶尺蛾沃尔巴克氏体菌去除，进而建立了不携带沃尔巴克氏体菌的灰茶尺蛾种群，为进一步开展沃尔巴克氏体菌的功能研究奠定了基础。

灰茶尺蛾；共生菌；沃尔巴克氏体；抗生素

昆虫体内栖息了大量的微生物，它们与宿主之间长期的协同进化过程中形成了相互依存的共生关系[1]。这些共生菌在宿主免疫、代谢、生殖等方面发挥了重要作用，因此，利用昆虫共生菌开发新型害虫防治技术具有重要的应用前景[2]。沃尔巴克氏体（）是广泛共生于自然界节肢动物宿主细胞内的一类革兰氏阴性细菌，可通过多种方式调节宿主的生殖方式[3]。其中细胞质不亲和（Cytoplasmic Incompatibility，CI）现象是最常见的表型，其特征为感染沃尔巴克氏体的雄性和未感染或感染不同沃尔巴克氏体品系的雌性宿主交配后，受精卵不能正常发育，在胚胎期死亡[4-5]。基于该理论开发出了利用沃尔巴克氏体防治蚊媒病的新型技术，该项技术已经在阻止登革热和寨卡病毒传播中成功应用[6-7]。

灰茶尺蛾（Warren）和小茶尺蠖（Prout）是茶园中最主要的1对近缘种食叶类害虫，二者形态相似，分布区域部分重叠[8]。前期研究发现二者能够交配并产生不可育的后代，且存在生殖竞争行为[9-10]。近期的研究发现二者共生菌群存在显著差异，特别是灰茶尺蛾体内自然携带沃尔巴克氏体，而小茶尺蠖不携带[11]。沃尔巴克氏体的差异是否介导了两种茶尺蠖生殖隔离？这是我们一直关注的科学问题。开展该方面的研究首先要建立不携带沃尔巴克氏体的灰茶尺蛾品系。目前，对于昆虫共生菌去除手段主要以抗生素处理为主，具体操作形式有显微注射和饲喂两种方法[12-13]。冯宏祖等[14]使用头孢氨苄饲喂处理苹果蠹蛾成功建立了不携带沃尔巴克氏体苹果蠹蛾品系。任素丽等[15]使用利福平饲喂处理Q型烟粉虱发现，利福平对其体内共生菌有良好的去除效果。谢蓉蓉等[16]使用四环素喂食处理二斑叶螨成功建立了不携带沃尔巴克氏体的二斑叶螨品系。上述研究结果均证明使用抗生素喂食处理是获得不携带某种共生菌品系的有效手段，但不同种类抗生素处理昆虫也会对其自身的免疫系统带来不同程度的伤害[17]。目前，选用何种抗生素能够达到去除灰茶尺蛾体内沃尔巴克氏体，同时保证其种群正常生长发育尚不清楚。本研究选取3种抗生素（四环素、头孢氨苄、利福平）对灰茶尺蛾进行饲喂处理以明确不同抗生素对沃尔巴克氏体的去除效果及其共生菌群落的影响，为进一步开展沃尔巴克氏体介导茶尺蠖两近缘种生殖隔离及遗传防治应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灰茶尺蛾采自浙江省新昌县（120.99° E，29.50° N）。野外收集灰茶尺蛾幼虫后带回实验室进行人工饲养。饲养条件：(25±1)℃；光周期为13 h/11 h（L/D）；相对湿度为75%~80%。采摘新鲜茶叶（迎霜品种）每天喂食，直至化蛹。将蛹按雌雄分开，待成虫羽化后，将雌雄成虫各两对置于500 mL养虫瓶中配对，同时在养虫瓶中放入2个产卵条[18]。

1.2 抗生素处理

选择四环素、头孢氨苄、利福平3种抗生素（麦克林公司，上海），配制质量浓度为2.5 mg·mL-1溶液分别对新鲜茶树叶片进行浸液处理1 min。抗生素处理过的叶片置于25℃、相对湿度为50%~60%条件下进行摊晾，待叶片表面溶液完全干后（约5 h），取适量处理过的茶叶对灰茶尺蛾进行喂食，并将处理组进行标记。每个世代取羽化2日龄成虫用于沃尔巴克氏体去除效果检测。连续处理3个世代后，对羽化2日龄的成虫进行随机取样用于共生菌群落测序。每个处理组和对照组选取雌雄虫各5头，每头样本单独保存在2 mL离心管中置于–80℃冰箱中待后续研究。

1.3 样品DNA提取

样品DNA提取采用试剂盒提取法。将样品成虫的翅用剪刀除去，剩余部分装入2 mL的灭菌EP管中并加入1粒4 mm的灭菌钢珠，置于振荡研磨器上研磨2 min。待样品研磨完成后按照血液/组织DNA提取试剂盒（天根生物技术有限公司，北京）操作手册逐步提取样品DNA，并保存于–20℃冰箱中备用。

1.4 共生菌群落扩增与测序

对DNA样本的16 S V3-V4变异区序列进行PCR扩增（引物341F：CCTACGGGNGGC WGCAG；805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC）[19]。扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，46℃退火20 s，65℃延伸30 s，5个循环；94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，20个循环；最后72℃延伸5 min[11]。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶检测，之后由浙江天科公司使用Illumina的MiSeq测序仪进行测序。

1.5 Wolbachia去除效果检测

使用的特异性引物_F1：GTCCAATARSTGATGARGAAAC；_R1：CYGCACCAAYAGYRCTRTAAA扩增基因进行去除效果检测[11]。扩增条件为：95℃预变性3 min；95℃变性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸90 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶检测。

1.6 数据分析

共生菌测序成功序列使用PEAR（V1.2.11）对每个样品的reads进行拼接，进一步对数据过滤得到有效数据（Effective tags）。利用Uparse软件（Uparse V8.1.1861）对所有样品的全部Effective tags进行聚类将序列聚类成为OTUs，对OTUs代表序列进行物种注释，用Uclust方法与Silva数据库（www.arb-silva.de）进行物种注释分析。使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods_coverag指数[11]。样品间差异性检验使用SPSS 17.0 （IBM）软件Tukey检验法，<0.05代表具有显著差异，<0.01代表具有极显著差异。

2 结果分析

2.1 灰茶尺蛾体内共生菌种群组成的差异序列拼接与注释

本研究共对4个处理（利福平L组、头孢氨苄T组、四环素S组、空白对照CK组，每组10头样本）的40头灰茶尺蛾样本进行了16 S rDNA的高通量测序，测序结果及质检信息见表1。每个样品的Q20值均大于98%，Goods_coverage值均大于0.99，代表该测序结果的准确性和注释覆盖率高，可满足后续分析要求。本次测序共获得了1 472 992条原始数据（每条平均长度为416 bp），经过质量控制和筛选后共得到1 281 916条有效tags用于后续分析。以97%的一致性作为相似性的阈值将序列聚类为598个OTUs，共注释到了22个门，40个纲，90个目，135个科，241个属，157个种。

我们对4个组别的OTUs进行比较分析。4个组别共注释到598个OTUs，其中43个核心OTUs在4个组中均有注释。核心OTUs经鉴定隶属于厚壁菌门Firmicutes（4科），变形菌门Proteobacteria（15科），放线菌门Actinobacteria（6科），拟杆菌门Bacteroidetes（鞘脂杆菌科Sphingobacteriaceae），微杆菌科门Microbacteriaceae（皮杆菌科Dermabacteraceae），软壁菌门Tenericutes（支原体科Mycoplasmataceae）。其中丰度最高的均来自肠球菌科Enterococcaceae（厚壁菌门），无浆体科Anaplasmataceae（变形菌门）和肠杆菌科Enterobacteriaceae（变形菌门），平均丰度分别为29.6%，28.2%和15.2%。L组与CK组相比，共有的OTUs 51个，独有的159个，被去除的40个；T组与CK组相比，共有的OTUs 69个，独有的168个，被去除的27个；S组与CK组相比，共有的OTUs 65个，独有的206个，被去除的31个（图1）。由此可见，抗生素去除掉了宿主自身的部分菌种同时也打破了原有菌落的平衡，而一些新菌种也会在宿主体内定植。

2.2 灰茶尺蛾体内共生菌的多样性和丰度差异

使用Alpha Diversity指数对每个样本的多样性和丰富度进行分析（图2），Shannon和Simpson指数反映菌群的多样性，指数越大多样性越高；Ace和Chao1指数反映样品中菌群的丰富度，指数越大丰富度越高。从Shannon和Simpson指数来看，对照CK组最大，分别为2.56和0.70，显著高于L组（1.43，0.42）和T组（0.56，017），与S组（1.97，0.47）并未形成显著差异。从Ace和Chao1指数来看，对照组最小，分别为52.17和47.96。极显著小于L组（83.26，80.60）和T组（92.76，87.90），但与S组（85.00，86.78）差异不显著。综合分析显示，使用3种抗生素处理后，灰茶尺蛾菌群均呈现出丰富度增加，多样性减小的变化规律，其中以头孢氨苄处理组最为明显。

注：韦恩图代表不同组别OTUs组成；右边代表共有的43个核心OTUs中丰度大于1%的菌群

注：*代表与对照组存在显著差异（P<0.05）；**代表与对照组存在极显著差异（P<0.01）

2.3 不同抗生素处理灰茶尺蛾样本相似度分析

基于OTUs注释结果对40个样品进行了PCoA相似性分析（图3），图中各点代表样品，点间距离越近代表样品在共生菌群组成上相似度越高。

分析结果显示，4个组别的灰茶尺蛾样品分布于相对独立的区域，说明4个组共生菌组成具有较为明显的差异。4个组别中样品相似度最高的为T组，其样品主要分布于第四象限；对照CK组中除样品G1外，其他样品全部分布在第二象限；L组和T组二者共生菌组成相对相似，样品主要分布在一、二、三象限，且组内样品间差异较其他两个组更大。

2.4 灰茶尺蛾体内共生菌群落种类及丰度差异

根据OTUs的注释结果，对照CK组获得的371 549条有效tags聚类为96个OTUs，共生菌群落注释到了10个门，19个纲，34个目，58个科，75个属，40个种；利福平处理L组获得的279 444条有效tags聚类为210个OTUs，共生菌群落注释到了13个门，27个纲，57个目，82个科，134个属，87个种；头孢氨苄处理T组获得的363 010条有效tags聚类为237个OTUs，共生菌群落注释到了15个门，30个纲，61个目，89个科，136个属，65个种；四环素处理S组获得的267 913条有效tags聚类为271个OTUs，共生菌群落注释到了17个门，30个纲，60个目，97个科，154个属，111个种（表2）。

在门的水平（图4），4个组别共生菌均以变形菌门、放线菌门、厚壁菌门为主，但在不同的组别中菌落的相对丰度有所差异。在对照CK组中主要共生菌丰度排名依次为变形菌门（79.13%），放线菌门（14.06%），厚壁菌门（5.13%）；在L组中排名依次为厚壁菌门（65.39%），变形菌门（30.15%），放线菌门（2.47%）；在T组中排名依次为变形菌门（94.74%），厚壁菌门（5.06%），拟杆菌门（0.06%）；在S组中排名依次为厚壁菌门（45.47%），变形菌门（33.79%），放线菌门（13.04%）。

图3 样品相似性PCoA分析

表2 灰茶尺蛾及不同处理组共生细菌分类的基本信息

在属的水平（图5），各组别共生菌群落组成差异较大。对照CK组中主要共生菌丰度排名前5的依次为沃尔巴克氏体属（，28.97%），肠球菌属（，24.17%），假单胞菌属（，14.82%），节杆菌属（，7.74%），蜜蜂球菌属（，5.09%）；L组中排名依次为蜜蜂球菌属（，61.12%），沙雷氏菌属（，15.63%），假单胞菌属（1.11%），鞘氨醇单胞菌属（，0.39%），节杆菌属（，0.28%）；T组中排名依次为沃尔巴克氏体属（84.05%），假单胞菌属（8.10%），蜜蜂球菌属（4.99%），鞘氨醇单胞菌属（1.84%），沙雷氏菌属（0.21%）；S组中排名依次为蜜蜂球菌属（43.50%），沙雷氏菌属（11.72%），链霉菌属（，7.57%），泛菌属（，5.13%），鞘氨醇单胞菌（3.71%）。以对照CK组的主要共生菌的变化比较分析发现，L和S组中5类共生菌呈现出相对一致的变化趋势。沃尔巴克氏体在L和S组中基本消除，但在T组中却呈现了更高的丰度占比；肠球菌属和节杆菌属在3个处理组中均只有很小的丰度占比；假单胞菌属在3个处理组中与对照组相比未呈现显著差异，但均呈现降低的趋势，尤其在L和S组中更为明显；蜜蜂球菌属在L和S组呈现显著上升趋势，但在T组中未发生显著变化（图6）。

2.5 灰茶尺蛾体内共生菌沃尔巴克氏体的去除效果

在使用抗生素对灰茶尺蛾进行处理过程中，每个世代取6个样品使用基因作为分子标记对沃尔巴克氏体进行检测。检测结果显示，使用抗生素处理1代后，3种抗生素处理组样品中均能检测到沃尔巴克氏体（S组中1个样品除外）（图7-A），说明使用3种抗生素饲喂处理灰茶尺蛾1个世代均不能将沃尔巴克氏体去除。抗生素连续处理2代后，L组和S组所有样品均检测不到沃尔巴克氏体，但T组所有样品中均能检测到沃尔巴克氏体，说明使用利福平或四环素抗生素连续处理灰茶尺蛾2个世代能够将沃尔巴克氏体去除，但头孢氨苄不能将其去除（图7-B）。抗生素连续处理3代后，T组中依然能够检测出沃尔巴克氏体，说明头孢氨苄对沃尔巴克氏体的去除效果并不理想（图7-C）。停用四环素10代后随机选取10个样品检测显示，该组群依然不携带沃尔巴克氏体并且生长发育正常（图8）。

3 讨论

昆虫共生菌是一类生活在昆虫体内与昆虫互相依赖、影响并协同进化的微生物[21]。昆虫共生菌种类与其栖息宿主环境及宿主自身的免疫、食性等多种因素相关[1]。因此，不同昆虫类群中共生菌种类和数量也存在一定程度上的差异。例如等翅目白蚁（）肠道优势共生菌为螺旋体门（Spirochaetes）、厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门[22]；半翅目褐飞虱（）肠道优势共生菌为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门[23]；鳞翅目中家蚕（）、小菜蛾（）、海灰翅夜蛾（）等肠道优势共生菌主要以变形菌门、厚壁菌门和放线菌门细菌为主[24]。虽然亲缘关系相近的昆虫共生菌在高级阶元具有相似性，但不同物种间在低级阶元依然存在着差异。以常见的几种鳞翅目昆虫为例，稻纵卷叶螟（）优势共生菌为类诺卡氏属（）和鞘脂单胞菌属（）[25]；甜菜夜蛾（）优势共生菌为不动杆菌属（）和噬氢菌属（）[26]；而在家蚕中不同品系其优势共生菌在属水平上的组成也存在差异[27]。在本研究中，灰茶尺蛾优势共生菌为沃尔巴克氏体（28.97%）、肠球菌属（24.17%）和假单胞菌属（14.82%），其中沃尔巴克氏体作为一类主要存在于节肢动物体内的共生细菌，其在宿主中的多种生殖调控机制是引起研究者广泛关注并持续开展探索的科学问题。由此可见，每种昆虫共生菌群落组成具备各自的特点，这种多样性也为研究共生菌功能及其与寄主之间的互作提供了充分的条件。

图4 样品主要共生菌相对丰度门水平的比例

图5 样品主要共生菌相对丰度属水平的比例

注：*代表与对照组存在显著差异（P<0.05）

图7 3种抗生素处理灰茶尺蛾后沃尔巴克氏体检测

图8 四环素停用10代后沃尔巴克氏体检测

本研究选择了3种抗生素（四环素、头孢氨苄、利福平）对灰茶尺蛾进行了饲喂处理以探索不同抗生素对沃尔巴克氏体去除效果及共生菌群落的影响。选取的3种抗生素在其他昆虫物种上均有除去沃尔巴克氏体的成功先例，但对灰茶尺蛾体内沃尔巴克氏体的去除效果却呈现了明显差异。使用四环素和利福平饲喂处理灰茶尺蛾两个世代后均能成功去除沃尔巴克氏体；而使用头孢氨苄连续饲喂处理灰茶尺蛾3个世代依然未能达到去除沃尔巴克氏体的效果。这可能与各抗生素抗菌机理不同有关。四环素主要通过干扰氨酰-tRNA与核糖体的结合而抑制细菌蛋白质的合成，对革兰氏阳、阴性细菌、细胞内支原体、衣原体和立克次体均有抑制效果[28]。头孢氨苄的抑菌机理是通过抑制细菌细胞壁的合成，使细胞内容物膨胀至细胞自溶，从而达到杀菌作用。头孢氨苄对革兰氏阳、阴性细菌均有抑制效果。利福平的抑菌机理是通过和依赖于DNA的RNA多聚酶的亚基结合，抑制细菌RNA的合成，从而阻断RNA转录过程，达到阻止DNA和蛋白的合成效果[13]。因此，3种抗生素饲喂处理灰茶尺蛾后对其共生菌群落影响也存在差异，推测可能头孢氨苄不能很好的抑制沃尔巴克氏体细胞壁的合成。目前，已有一些使用抗生素对不同昆虫体内沃尔巴克氏体去除效果的相关报道[12-13]，但对其作用机理方面尚未见报道。即使同种抗生素对不同昆虫体内沃尔巴克氏体去除效果也存在差异。由此可见，抗生素对沃尔巴克氏体的去除机制研究中不仅涉及了抗生素自身的抑菌机理而且与寄主体内微环境及抗菌肽等多种因素相关。现有的研究显示，尚无成功分离培养沃尔巴克氏体的相关报道，一定程度上限制了对其功能作用的研究。本文首次对抗生素影响灰茶尺蛾共生菌群效果进行研究，结果显示，四环素和利福平对灰茶尺蛾优势菌群（排名前5）中沃尔巴克氏体属、肠球菌属和节杆菌属均有显著的去除效果；而头孢氨苄仅对肠球菌属和节杆菌属具有显著的去除效果。另外，头孢氨苄处理后沃尔巴克氏体，四环素和利福平处理后蜜蜂球菌属的相对丰度均显著提高。这可能与菌群之间的抑制作用有关，尚需进一步研究。

综上所述，本研究选了的3种抗生素对灰茶尺蛾进行了饲喂处理，通过分子标记检测，四环素和利福平连续饲喂灰茶尺蛾两个世代后均能达到去除沃尔巴克氏体的效果。而使用分子对停用四环素10代后样品检测显示，该种群依然不携带沃尔巴克氏体并且生长发育正常。通过上述方法首次成功建立了不携带沃尔巴克氏体的灰茶尺蛾种群。目前，现有的研究显示沃尔巴克氏体能够通过多种机制调控宿主的生殖行为，常表现为诱导宿主发生细胞质不亲和（CI）、雄性致死（MK）、诱导孤雌生殖（PI）、雌性化（Feminization）、增强雌性繁殖力和雄性生育力等[3]。此外，沃尔巴克氏体对宿主的营养代谢、抗逆能力等方面同样具有调控作用[21]。不携带沃尔巴克氏体的灰茶尺蛾种群的建立实现了开展沃尔巴克氏体在宿主灰茶尺蛾中功能研究的可能性，特别是在灰茶尺蛾与其近缘种茶尺蠖二者间生殖隔离机制研究方面具有重要的意义。沃尔巴克氏体通过何种方式调控茶尺蠖两近缘种之间的生殖行为？沃尔巴克氏体是否是二者分化早期的驱动因素？这些科学问题也是我们获得了不携带沃尔巴克氏体的灰茶尺蛾种群之后计划开展的研究方向。

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Effect of Three Antibiotic Treatments on Bacterial Endosymbiont Community ofWarren

WANG Zhibo, BAI Jiahe, ZHOU Xiaogui, GUO Huawei, XIAO Qiang*

Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In order to study the effects of three antibiotics on bacterial endosymbiont community of, relative experiment was carried out with three antibiotics (tetracycline, cefalexin and rifampicin) at the concentration of 2.5 mg·mL-1. Larvae ofwere fed the tea leaves with antibiotics for continuous 3 generations. Variation of endosymbiont community was studied using 16 S rDNA Illumina MiSeq technique. Besides, theofwere detected basing ongene.The results show thatabundance and diversity of endosymbiont community inwere increased and reduced,respectively under antibiotic treatments. The tetracycline and rifampicin could effectively removefromFurther, the population ofwithoutwas established, which laidthefoundationfor thestudy on functionof

, symbiotic bacteria,, antibiotics

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2021)01-090-11

2020-08-12

2020-09-30

国家自然科学基金（31700613）、中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）

王志博，男，副研究员，主要从事茶园病虫害防治研究，wangzhibo9527@163.com。*通信作者：xqtea@vip.163.com

(责任编辑：赵锋)