昭通苹果早期落叶病叶中一种新病原菌的发现研究

邓 潇，陈 宇，马仲炼，黄先敏

(昭通学院农学与生命科学学院，云南昭通，657000)

苹果早期落叶病是指苹果树在生长季节非正常大量落叶病害的统称[1]。早期落叶病是昭通苹果产区的主要病害，发病普遍，危害严重[2]。据报道，早期落叶病有苹果斑点落叶病、褐斑病、灰斑病及圆斑病4种类型。早期落叶病影响幼树适龄结果及早期生产，削弱树势、降低果实产量及品质等[3]。斑点落叶病是由苹果链格孢菌(AlternariamaliRoberts)引起，病原菌属半知菌亚门真菌，侵染苹果叶片，引起早期落叶病[4]。斑点落叶病叶上病斑近圆形，灰褐色，有轮纹，上生子实体[5]。苹果褐斑病是由苹果盘二孢菌(Marssoninamali)引起，病斑近圆形，褐色或紫褐色，边缘不明显，造成树叶早落[6]。苹果灰斑病由梨叶点霉菌(PhyllostictapyrinaSacc.)引起[7-8]，叶片上形成黄色至灰色的病斑，在成熟的叶片上多呈近圆形坏死斑，病斑上散生的黑色小点，是病菌的分生孢子器[9-10]。苹果圆斑病是一种高等真菌性病害，由孤生叶点霉(Phyllostictasolitaria)引起，叶片受害形成褐色圆斑[11-12]。

至今报道，引起苹果早期落叶病的病原菌有：苹果盘二孢菌、苹果链格孢菌、梨叶点霉菌及孤生叶点霉菌4种病原菌。除去这4种病原菌，还未曾见有过其他引起早期落叶病病原菌的报道。2019年10月，作者在云南省昭通市旧圃镇大村的一个苹果园中，发现了该园中的许多苹果树感染了早期落叶病。采集其中感病最为严重的4株苹果树的病叶带回实验室，从中分离纯化出一种新的病原菌。本试验从病原菌的分离纯化[13]、培养特性、显微结构观察[14]及柯赫氏法则进行致病性测定[15]等方面，确定所分离纯化出的病原菌是苹果叶部病害上新的病原菌，该试验结果可为苹果早期落叶病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苹果早期落叶病叶采自云南省昭通市旧圃镇大村苹果园，果园地处三面环山的山谷，苹果品种为红富士，树龄24年。选择园中患病最为严重的4株苹果树，每株病树按东、南、西、北4个方向采摘病叶，每个方向采摘病叶6片，共计96片病叶。柯赫氏法则进行致病性测定所用接种苹果树为两年生盆栽红富士苹果树。

1.2 试验方法

采用常规组织分离法、稀释涂布法及划线纯化法，对苹果早期落叶病叶中的病原菌进行分离和纯化。采用插片法制作病原菌涂片，用CX40生物光学显微镜对病原菌的结构进行观察。按照柯赫氏法则进行致病性测定。

1.2.1 病原菌的分离纯化

将从果园采回的早期苹果落叶病叶剪碎，称取剪碎病叶10 g，放入盛90 mL无菌水的三角烧瓶中，用超声波清洗器振荡约5 min，使病叶组织中的病原菌充分分离出来，均匀分散在无菌水中。然后在无菌操作台内，用移液器吸取1 mL液体，加入盛有9 mL无菌水的试管中，充分混匀。再用移液器从此试管中吸取1 mL病叶组织液，加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀。以此类推，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释浓度的植物病叶组织悬液。

用移液器分别吸取稀释梯度为10-3、10-4和10-5的苹果落叶病叶悬液1 mL，放入PDA培养基平板中，每一种稀释梯度做3个重复。再用无菌涂布棒将病叶悬液沿同心圆轻轻地向外扩展，涂抹均匀，静置10 min。然后将平板倒置于温度28 ℃、湿度80%的人工气候箱中培养。

经过20 h后，PDA平板上长出直径约2 cm的菌落，挑取单个菌落，用划线接种法接种于PDA平板上进一步纯化培养，对分离得到的菌株，再进一步做试管斜面纯化，得到纯化的病原菌菌株。

1.2.2 病原菌的显微制片

用插片法对病原菌进行显微制片，将消毒灭菌后的盖玻片以45°的斜角插入PDA平板中，再将纯化好的病原菌用接种环刮取病原菌后，接种环在培养基与盖玻片的交界处划线。将平板倒置于温度28 ℃、湿度80%的人工气候箱中培养观察，经培养2 d后，菌丝长满平板，将盖玻片用无菌镊子取出，制作临时装片，在光学显微镜下进行病原菌的结构观察。

1.2.3 病原菌接种苹果叶片

将纯化好的病原菌采用柯赫氏法则进行回接致病性试验。室外试验，时间是6月的中、下旬，温度在15～29 ℃，平均相对湿度在49%～83%。在纯化好的病原菌试管中，加入无菌水9 mL后，用接种环轻轻刮病原菌，制成病原菌悬浮液备用。用75%酒精把2年生盆栽红富士苹果树叶擦拭干净，再用无菌水冲洗干净。用无菌接种针在树叶上扎成直径约5 mm的伤口，在伤口处涂抹上病原菌悬浮液。每株树的4个方向分别选择6片树叶做有伤接种，同时以无菌水用上述同样的方法接种叶片作为对照，进行观察比较。

1.2.4 接种病原菌感病叶片中的病原菌

分离纯化及显微观察

将纯化出的病原菌接种苹果树叶后，采摘感病叶片参照步骤2.2.1进行分离纯化；参照步骤2.2.2制作病原菌的显微图片。

2 结果与分析

2.1 病原菌的培养特性

将纯化好的病原菌，接种在PDA培养基上，观察病原菌在PDA培养基上的生长情况。试验结果看出，病原菌接种PDA后，经过9 h，在PDA平板上长出肉眼可见的淡白色菌落，直径1 cm。18 h时，培养基上菌落变大，直径约2 cm，呈白色，长出绒毛状菌丝。培养基背面无明显变化。23 h时，菌落直径3 cm，白色绒毛状菌丝长约1 mm，接种点处变为灰色，培养基背面中央为白色。26 h时，菌落直径4 cm，菌落边缘白色绒毛状菌丝匍匐于培养基上，宽约1 cm，中央直立菌丝长约2 mm，培养基背面中央白色加深。32 h时，菌丝长满整个平板，中央直立菌丝抵达皿盖，周围菌丝较矮，匍匐于培养基上，培养基背面中央白色面积扩大。40 h时，菌丝由白色变成浅褐色，培养基背面由白色变成浅灰色。46 h时，菌丝呈现灰色或褐色，培养基背面为灰色或浅黄色(见图1)。

图1 病原菌的培养特征(A为正面，B为反面)

2.2 病原菌的显微观察

采用插片法，使病原菌长在盖玻片上，做成临时装片。在CX40显微镜下进行观察，可得病原菌的显微结构图(见图2)。

从图2中可以看出，在40倍和100倍显微镜下，该病原菌的结构完整，菌丝为无隔膜菌丝，具有假根和匍匐枝，假根相对处向上长出孢囊梗，2根孢囊梗簇生在一起(图2-A、B)。在200倍下，孢囊梗单生，不分枝，顶端产生孢子囊。孢子囊球形，囊轴明显，基部有囊托，内有大量孢囊孢子(图2-C)。在400倍下，孢囊孢子球形、卵形或不规则形，有棱角，表面有线纹，无色至淡褐色(图3-D)。

A：40倍显微镜下的病原菌结构图；B：100倍显微镜下的病原菌结构图；C：200倍显微镜下的孢囊梗和孢子囊；D：400倍显微镜下的孢囊孢子图2 早期苹果落叶病叶中分离出的病原菌的显微结构

2.3 病原菌侵染叶片过程观察

根据柯赫氏法则，将纯化的病原菌菌株进行回接试验，观察病原菌对苹果树叶的感染情况，以无菌水作为对照。结果见图3。

从图3中可以看出，病原菌接种到树叶后，树叶的感染过程为：在接种初期，树叶无明显症状，到接种86 h后，接种树叶出现长度为0.5 cm的不规则形病斑，病斑为褐色，病、健部分界明显(图3-C)。接种96 h后，病斑扩大，形状不规则，直径1 cm左右，病斑为褐色，病、健部分界明显(图3-D)。接种108 h后，病斑扩大至叶面积的1/4，形状不规则，病斑中央颜色为红褐色，边缘为紫褐色(图3-E)。接种132 h后，病斑不再扩大，病斑直径2～3 cm，颜色为棕色至褐色，形状不规则，边缘颜色较深，病斑干燥易破裂(图3-F)。以无菌水做对照的试验组，从接种无菌水到132 h，在树叶上均未出现任何症状，同时，用接种环在树叶上划的伤口已愈合。

A—B:对照组，接种0.05 mL无菌水；C—F:试验组，接种0.05 mL病原菌菌悬液图3 病原菌侵染苹果叶片症状

将从苹果园中采集的早期落叶病叶中分离、纯化的病原菌菌种，转接到苹果树叶上，能够感染苹果叶片，受感染的树叶症状与田间采回病叶的症状一致。

2.4 接种感病叶片中病原菌的显微结构

将接种病原菌后感病叶片进行组织分离，获得病原菌。采用插片法使病原菌长在盖玻片上，制成临时装片，进行显微结构观察，结构如图4。

从图4中可以看出，从转接病原菌叶片中分离出的病原菌结构，与从果园中采集病叶中分离的病原菌显微结构一致。菌丝为无隔菌丝(图4-B、C)，具有假根和匍匐枝(图4-A)，孢囊梗与假根相对生长。孢囊梗单生，不分枝，顶端产生孢子囊。孢子囊球形，囊轴明显，基部有囊托，内有大量孢囊孢子，孢囊孢子球形、卵形或不规则形，有棱角。可见，接种后与果园采集的病原菌是同一种病原菌。

A：40倍显微镜下病原菌的结构图；B：100倍显微镜下病原菌的结构图；C：200倍显微镜下病原菌的孢囊梗、孢子囊及孢囊孢子图4 从转接病原菌苹果叶片上分离出的病原菌显微结构

3 结论与讨论

本试验从苹果早期落叶病叶中分离、纯化出的病原菌，在PDA培养基上的培养特性是，28 ℃时，在PDA培养基上快速生长，32 h时即长满整个培养皿，先为白色，后变浅褐色至黑色。反面起先白色，后变成灰白色。匍匐菌丝起先白色，后变褐色。显微结构为具有假根和匍匐枝，假根分枝多，发育良好。孢子囊柄直立，不分枝，褐色，2枝簇生，长在假根对侧，菌丝无分隔，细胞壁平滑。孢子囊球形，囊轴明显，基部有囊托，内有大量孢囊孢子，孢囊孢子数量多，呈球形、卵形或不规则形，有棱角，表面有线纹，无色至淡褐色。参照陆家云的《植物病害真菌学》及陈江华的文献[5,16]，可以确定本试验中，从早期落叶病叶中分离出的病原菌为匍枝根霉菌(Rhizopusstolonifera)。关于匍枝根霉侵染、危害植物果实有过报道[17]，而对植物叶片的侵染危害，还未曾见有过报道。

报道引起苹果早期落叶病的病原菌有：引起斑点落叶病的苹果链格孢菌，引起苹果褐斑病的苹果盘二孢菌，引起苹果灰斑病的梨叶点霉菌和引起苹果圆斑病的孤生叶点霉。早期落叶病叶中有匍枝根霉病原菌的报道还未曾见有过。苹果链格孢菌在PDA培养基上培养1 d后，接种点的边缘有青褐色菌丝长出。培养3 d后，产生大量分生孢子，呈倒梨形、近卵状，具横隔，分生孢子链细长。7 d后，长满培养皿，呈圆形。菌落中央黑色，外部青褐色，边缘色浅。气生菌丝较短，可见褐色粉状物[18]。在PDA 平板上，苹果盘二孢病菌生长缓慢，菌落近圆形，隆起，黑色至黑褐色，表面不光滑，呈蚯蚓粪状，无气生菌丝，边缘不规则，观察不到子实体和基内菌丝。苹果褐斑病叶叶片变黄易脱落，病、健交界处不明显[19]。苹果灰斑病的病原菌为梨叶点霉菌，其分生孢子无色、单胞，内含一个油球，聚集在一起时呈淡黄色[5]。苹果圆斑病的病原菌为孤生叶点霉，菌落正面墨绿色或灰白，反面墨绿色，近似圆形，全缘，稠密，中央气生菌丝发达，灰色。分生孢子器球形或椭圆形，上端具1孔口，深褐色；分生孢子单胞、无色，椭圆形或卵形，内具透明状油点[6]。可见，该试验所分离出来的病原菌是与以往不同的一种病原菌。

通过常规组织分离、柯赫氏法则验证及病原菌的鉴定(培养特性和显微结构)，证实从苹果早期落叶病叶中分离出来的病原菌是匍枝根霉菌，匍枝根霉感染苹果落叶病的报道未曾见到，这是首次发现存在苹果落叶病叶中的病原菌——匍枝根霉，该发现可为苹果早期落叶病的防治提供依据。