大蒜素对急性心肌梗死大鼠心功能和心肌纤维化的影响*

张丽娜，刘津军，王绍伟

(邯郸市中心医院 心内三科，河北 邯郸 056000)

随着高血压、高血脂、高血糖等基础疾病患病人群的增加以及人口老龄化，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的发病率呈逐年上升趋势[1-2]。AMI发生后心肌血、氧供给不足导致心肌纤维化，是导致心功能损伤、心力衰竭和死亡的重要因素[3]。大蒜素是天然存在于大蒜鳞茎中的一种活性化合物，目前临床上用于深部真菌和细菌感染的治疗。近年来研究发现，大蒜素对肝纤维化、肾纤维化具有抑制作用[4-6]。本实验探讨大蒜素对AMI大鼠心功能和心肌纤维化的影响及其相关机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康、SPF级雄性SD大鼠100只，7周龄，体质量220 ～230 g，购自河北省实验动物中心[SCXK(冀)2018-004]，实验前适应性饲养7 d。

1.1.2药物与试剂 大蒜素注射液(规格2 mL ∶30 mg)购自徐州莱恩药业有限公司(批号20190714)，N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)ELISA试剂盒、Masson染色试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司，胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅲ、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、转化生长因子-β(TGF-β)以及磷酸化Smad2(p-Smad2)抗体购自北京索莱宝科技有限公司，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒以及ECL化学发光试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器 ALC-V8型动物呼吸机和BL-A420型心电图机(上海精密科学仪器有限公司)，Vevo-2100型动物超声仪(加拿大Visual Sonics公司)、RM2235型石蜡切片机(德国Leica公司)、MTP-601F型荧光酶标仪(日本Corona公司)、IX81型倒置光学显微镜(日本Olympus公司)，VE-180型电泳槽、VE-186型转膜仪(上海天能科技有限公司)，Flour Chem M型凝胶成像分析仪(美国Protein Simple公司)。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组、给药与模型制备 将100只实验用大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和大蒜素低、中、高剂量组(5、10和20 mg/kg)[7]，每组20只。取大蒜素注射液加入适量生理盐水制备浓度为10 g/L的大蒜素溶液，并依次稀释制备浓度5g/L和2.5 g/L的大蒜素溶液，造模手术前10 min，大蒜素低、中、高剂量分别腹腔注射给予浓度2.5、5、10 g/L的大蒜素溶液，注射剂量为2 mL/kg，假手术组和模型组同步腹腔注射同剂量生理盐水(2 mL/kg)。参照吴庆景等[8]方法，在心电图实时监控下，模型组和大蒜素各组结扎左冠状动脉前降支复制AMI大鼠模型；结扎后左心室颜色苍白、心电图ST段弓背持续抬高或T波高耸，可判定造模成功[9]；假手术组除不结扎左冠状动脉前降支外，其余同模型组。术后24 h后行各指标检测。

1.2.2心功能指标检测 各组按照随机数字表法随机取10只大鼠，通过动物超声仪检测心功能指标[左心室舒张末期内径(LVIDd)、收缩末期内径(LVIDs)、射血分数(EF)、每搏输出量(SV)]，连续检测3个心动周期，取平均值。

1.2.3血清NT-proBNP水平检测和心脏指数计算 麻醉后开腹，由腹主动脉取血，1 500 r/min离心10 min取血清，按照ELISA试剂盒操作说明处理后，通过酶标仪检测血清NT-proBNP水平。称量大鼠体质量(W1)，开胸取心脏，用生理盐水冲洗干净并拭干后称重(W2)，心脏指数=(W2/W1)。

1.2.4心肌组织病理学检查和心肌纤维化程度观察 切取左心室心肌组织置于10%中性福马林溶液中固定24 h，石蜡包埋、5 μm厚度连续切片。(1)行常规HE染色后，通过光学显微镜观察心肌组织病理学改变并照相保存。(2)遵照Masson染色试剂盒操作说明处理，封片后通过显微镜观察心肌纤维化程度(肌纤维呈红色，胶原呈蓝色)并照相保存；通过图像分析系统计算胶原容积分数(CVF)，CVF(%)=(胶原面积/视野总面积)×100%。

1.2.5心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白检测 取各组剩余的10只大鼠，麻醉后开胸取左心室心肌组织，剪碎后加入9倍量4 ℃裂解液、研磨匀浆，12 000 r/min离心20 min后取上清液，参照BCA试剂盒方法检测总蛋白含量、95 ℃水浴5 min使蛋白变性后，以30 μg蛋白量上样、SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h、PBS溶液洗膜后，滴加Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白抗体、β-actin抗体4 ℃、避光孵育12 h，洗膜后滴加二抗室温孵育1 h，洗膜后滴加ELC显影，以β-actin为内参半定量目标蛋白表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠心功能

与假手术组比较，模型组大鼠LVIDd和LVIDs明显升高，EF和SV明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组LVIDd和LVIDs降低、EF和SV升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠LVIDd、LVIDs、EF和SV

2.2 血清NT-proBNP水平和心脏指数

与假手术组比较，模型组大鼠血清NT-proBNP水平和心脏指数明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，大蒜素低、中、高剂量组NT-proBNP水平降低，中、高剂量组心脏指数降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

2.3 心肌组织学观察

假手术组大鼠心肌组织形态、结构均未见异常；模型组可见心肌纤维断裂、排列紊乱，细胞数量减少、排列不整，心肌细胞膜破裂，可见核碎裂、消失，核偏移固缩深染，大量炎性细胞浸润等病理性改变；较模型组，大蒜素各剂量组上述心肌组织缺血性病理改变明显改善，高剂量组心肌纤维未见明显断裂，炎性细胞浸润明显减轻，优于其它组。见图1。

注：A为假手术组，B为模型组，C为大蒜素低剂量组，D为大蒜素中剂量组，E为大蒜素高剂量组。

2.4 大蒜素对AMI大鼠心肌纤维化的影响

假手术组大鼠可见少量、均匀分布的胶原纤维；模型组胶原含量明显增多、分布不均，以血管周围和纤维断裂处增多较为显著；较模型组，大蒜素各剂量组胶原含量呈不同程度减少，其中高剂量组血管周围和纤维断裂处胶原接近假手术组。较假手术组，模型组CVF明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；较模型组，大蒜素中、高剂量组CVF明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2、表2。

表2 各组大鼠血清NT-proBNP水平、心脏指数及CVF

注：A为假手术组，B为模型组，C为大蒜素低剂量组，D为大蒜素中剂量组，E为大蒜素高剂量组。

2.5 心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达

较假手术组，模型组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ以及MMP-2表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)；较模型组，大蒜素中、高剂量组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ以及MMP-2表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3、表3。

表3 各组大鼠心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ以及MMP-2蛋白的表达

注：A为假手术组，B为模型组，C为大蒜素低剂量组，D为大蒜素中剂量组，E为大蒜素高剂量组。

2.6 心肌组织TGF-β、p-Smad2蛋白表达

较假手术组，模型组大鼠心肌组织TGF-β、p-Smad2表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)；较模型组，大蒜素中、高剂量组TGF-β、p-Smad2表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4、表4。

注：A为假手术组，B为模型组，C为大蒜素低剂量组，D为大蒜素中剂量组，E为大蒜素高剂量组。

表4 各组大鼠心肌组织TGF-β、p-Smad2蛋白的表达

3 讨论

AMI发生后，随着心肌细胞坏死与间质细胞的大量增生导致心室的形态、结构发生转变，即心室重构，从而影响心脏功能[10]，而心肌纤维化是导致心室重构、进而诱发心力衰竭甚至致死的重要因素[11-12]。因此，抑制心肌纤维化对改善AMI预后至关重要。

近年来，随着中医药现代化研究的深入，中医药治疗心血管疾病逐渐得到医生和患者的关注与认可。大蒜素是天然存在于大蒜鳞茎中的一种二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性[13-15]。目前临床上主要用于深部真菌和细菌感染的治疗，近年来对于大蒜素潜在适应症开展了大量研究，其中大蒜素抗肝、肾纤维化作用已得到证实。血清NT-proBNP水平能够反映心功能状况，是心肌纤维化和心力衰竭的常用早期诊断指标[16-17]。本实验结果显示，经大蒜素干预能够明显降低AMI大鼠LVIDd、LVIDs值并提高EF、SV值，降低血清NT-proBNP水平和心脏指数，改善心肌纤维断裂、细胞膜破裂、核碎裂消失，核偏移固缩深染以及炎性细胞浸润等心肌组织病变，降低心肌纤维化程度，提示大蒜素具有保护AMI大鼠心功能并抑制其心肌纤维化的作用。

AMI发生后，心肌成纤维细胞在缺氧缺血环境中异常增殖，由其合成与分泌的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ大量积累，是导致心肌纤维化的重要物质基础[18-19]。基质金属蛋白酶(MMPs)，尤其是MMP-2，能够通过影响心肌胶原蛋白含量，进而参与心肌纤维化、心肌肥厚等生物学过程[20]。Meng等[21]研究发现TGF-β能够激活多条信号通路，能够通过诱导Smads磷酸化(p-Smads)刺激成纤维细胞增殖与合成、释放胶原蛋白，并且能够抑制细胞外基质降解，因此TGF-β/Smads信号通路在心肌纤维化过程中发挥着关键调控作用。此外，Yuan等[22]研究发现，通过药物阻断TGF-β/Smads信号通路则能够抑制成纤维细胞增殖并下调Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达，能够起到缓解心肌纤维化的作用。本研究发现，经大蒜素干预能够明显下调AMI大鼠心肌Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TGF-β以及p-Smad2表达，提示大蒜素对AMI大鼠心肌纤维化的抑制作用可能与抑制TGF-β/Smad信号通路，进而下调Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达有关。

综上所述，大蒜素具有保护AMI大鼠心功能并抑制心肌纤维化的作用，其机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路、下调Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表达有关。