膜性肾病与非编码RNA

车秀清 米 焱 王彩丽

膜性肾病(membranous nephropathy，MN)是一种肾脏特异性的自身免疫性疾病，是成人肾病综合征常见的病理类型之一，约1/3的MN患者会进展为终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)。目前，MN的确诊仍依靠肾穿刺活组织检查(简称活检)，以监测病情变化和治疗效果，但因其为有创检查，不便反复进行，因此仍需要不断积极探索MN的发病机制和新型生物标志物，非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)研究的不断深入为阐明MN的发生机制提供了思路，也为MN的诊断和治疗带来了希望。

1 MN的发病机制

MN的病理学特征表现为肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚。其中大多数病因不明的MN被称为特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)或原发性膜性肾病(primary membranous nephropathy，PMN)，而由自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮等)、感染、肿瘤、代谢性疾病、药物等引起的MN被称为继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy，SMN)。IMN的发病机制复杂，具体机制尚未完全明确，可能有多重因素参与。近年来，IMN特定抗原的发现促进了IMN的机制研究和诊断。研究发现，多种足细胞膜抗原如M型磷脂酶A2受体(PLA2R)[1-2]、Ⅰ型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)[3]、中性肽链内切酶(NEP)[4]与IMN的发生有关。血清中超氧化物歧化酶(SOD2)、醛糖还原酶(AR)、α-烯醇化酶(α-ENO)等细胞内抗原也可能是导致IMN发生的抗原成分[5]。其中PLA2R1抗体(PLA2R1-Ab)水平与疾病活动和缓解、药物治疗反应[6]、肾移植后疾病复发[7]相关，并且可以预测肾脏长期预后[8-9]，血清PLA2R1-Ab检测已应用于IMN的临床诊断和治疗。此外，遗传易感性[10]、环境因素[11]、补体激活[12]等也与IMN的发生有关。

2 ncRNA的分类

人类基因组中只有约1.5%可以编码为蛋白质，绝大部分转录为ncRNA，ncRNA是一类不能编码蛋白质而在转录前或转录水平发挥生物学功能的RNA，包括核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)、转运RNA(transfer RNA，tRNA)、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)、小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)和小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)等。

随着基因测序技术和生物信息学的发展，ncRNA的种类不断被完善，其生物学功能也逐渐受到重视，成为近年来生命科学的研究热点，其中对miRNA的研究较为丰富。许多研究结果表明，ncRNA在细胞生命活动中发挥着重要作用，并且ncRNA表达失调与多种疾病的发生、发展过程有关，也可能参与了多种肾病的病理生理过程。探究ncRNA与MN的关系有利于阐明MN的发病机制，为治疗MN提供新的治疗靶点。ncRNA在血液、尿液中稳定存在，可无创检测，并且在不同肾脏疾病中的表达有相对特异性，因此有望成为诊断IMN的新的无创生物学标志物，并有助于监测IMN病情发展，以及评估疗效和预后。

3 MN与ncRNA

3.1 MN与miRNA miRNA是一类广泛存在于真核生物中的内源性非编码小分子单链RNA，通常由21～25个核苷酸组成，具有高度保守性，其本身不具有开放阅读框架，通过参与转录后基因调控影响机体的病理生理过程，与细胞发育、分化、增殖、凋亡，以及免疫调节、肿瘤发生等有关[13]。

miRNA在人体的各个组织和器官中广泛表达，一个miRNA可调控多个靶基因，每个靶基因可受多个miRNA调控，从而构成了复杂的miRNA调控网络。大多数miRNA表达具有组织特异性和发育阶段特异性，不同组织中miRNA的表达谱和表达量有差异，且在疾病发生、发展的不同阶段表达谱也存在差异。由于miRNA在不同肾脏疾病中存在特异性表达，以及其在不同肾脏疾病中所起的作用不同，调控miRNA表达水平成为治疗肾脏疾病的潜在方法。

许多研究已经证明，MN患者的血液、尿液和肾组织中的miRNA表达与正常人群存在差异。Chen等[14]利用高通量测序技术在全基因组范围内对MN患者组和正常对照组外周血淋巴细胞(PBLC)中miRNA表达谱进行了分析，两组间共有326个miRNA的表达有显著差异，包括286个下调的miRNA和40个上调的miRNA。失调的miRNA可能在MN的发病机制中发挥着重要的作用。一项研究[15]发现，MN患者尿液中的miRNA-193a较正常者表达明显上调，随着IMN严重程度的增加，尿液中miRNA-193a的表达也明显上调；此外，miRNA-193a的表达与蛋白尿水平显著相关，miRNA-193a过表达往往也预示着肾脏存活率低。Zhou等[16]的研究结果则表明，MN患者外周血和尿miRNA-195-5p、miRNA-192-3p表达增多，miRNA-328-5p表达减少，其相应的靶基因PPM1A、RAB1A和BRSK1的表达则呈相反的变化，推测这3个基因可能通过炎症和凋亡相关通路参与MN，如PPM1A和BRSK1可以通过参与MAPK相关的信号途径，RAB1A可以通过涉及p53信号途径(CDK1-RAB1A)与MN相关联，提示这些miRNA及其靶基因作为诊断MN的关键生物标志物。

研究[17]发现，MN患者肾组织的miRNA-186表达明显下调，体外实验也证明miRNA-186通过Toll样受体4(TLR4)、P2X7和半胱天冬酶3(caspase-3)参与足细胞凋亡。 Li等[18]的研究发现，miRNA-217通过靶向肿瘤坏死因子超家族成员11(tumor necrosis factor superfamily member 11，TNFSF11)促进足细胞的凋亡，进而参与MN的发病机制。该研究在MN患者的肾脏组织和血浆中均检测到miRNA-217的表达量明显下调，同时肾脏组织中TNFSF11基因和蛋白质表达量明显上调；此外，通过体外转染miRNA-217干扰载体到足细胞，使miRNA-217表达下调，同时TNFSF11基因表达量明显上调，证实了TNFSF11是miRNA-217的靶基因，进一步证明了miRNA-217诱导足细胞发生凋亡。这些研究结果提示，miRNA可通过促进足细胞的凋亡导致MN的发生。

3.2 MN与lncRNA lncRNA是一类长度>200个核苷酸的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，不具有编码蛋白质的能力。lncRNA亦可通过不同的作用机制在基因表达的各个阶段发挥重要作用，其调节细胞核内染色质的结构和转录，在细胞质中调节 mRNA的稳定性、翻译和翻译后修饰(PTM)[19]。lncRNA在表观遗传、转录，以及转录后水平等多层面调控基因的表达，与细胞分化和组织发育、染色体剂量补偿、染色质重构、基因组印记等有关，参与动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等心血管疾病和多种肿瘤疾病[20]。

近年来，lncRNA与肾脏疾病的研究逐渐增多，lncRNA被报道与多种肾小球疾病相关，如糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化、狼疮肾炎等，并参与了急性肾损伤、CKD、常染色体显性遗传多囊肾病、肾结石、尿酸性肾病等多种小管间质疾病[21]。

目前，关于MN与lncRNA的研究较少，被发现表达异常的lncRNA主要为X(染色体)失活特异性转录物 (X-inactive specific tran，XIST)。XIST是由X-失活中心(Xic)基因位点转录的一种与X染色体失活有关的lncRNA。Huang等[22]发现lncRNAXIST和NEAT1在MN小鼠模型的肾小管上皮细胞和肾小球细胞中表达均显著上调，并且与MN的严重程度呈正相关。脂多糖(lipopolysides, LPS)诱导小鼠肾脏足细胞损伤后，足细胞中XIST水平稳定升高，但NEAT1水平未升高。进一步检测MN小鼠和肾小球肾炎患者(包括MN)的尿液，发现XIST水平明显升高，并且尿XIST浓度与MN的严重程度呈正相关。进一步研究发现，XIST的调控可能受到翻译后修饰的控制，因为MN小鼠肾脏中组蛋白27氨基酸三甲基化(H3K27me3)水平显著下调，染色质免疫沉淀实验也显示XIST启动子区H3K27me3水平下降，提示当MN被诱导时，XIST启动子H3K27me3的水平降低导致XIST水平升高。因此，尿液中XIST是MN的潜在生物标志物。

足细胞凋亡是MN发生的关键过程，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可诱导足细胞的凋亡。Jin等[23]发现，AngⅡ通过上调TLR4表达促进MN足细胞凋亡，同时再次验证了在MN肾组织中XIST表达明显上调，而XIST表达下调可逆转AngⅡ诱导的足细胞凋亡，同时MN肾组织中miRNA-217的表达显著下降，TLR4水平升高，由此推测XIST可能是通过miRNA-217负性调节足细胞中TLR4的表达。该实验也证明了下调XIST表达可激活miRNA-217/TLR4通路改善足细胞凋亡，从而改善MN，为MN的治疗提供了有效的靶点。

3.3 MN与circRNA circRNA是一类特殊的闭合环状的内源性ncRNA，与线性RNA不同，circRNA没有典型的5’帽子结构和3’polyA尾，故不被核酸外切酶所识别，且其为共价闭合环状结构，具有很强的稳定性。随着高通量测序技术的发展，被发现的circRNA的种类逐渐增多，其与多种疾病的关联也逐渐引起人们的关注，目前已发现circRNA在神经系统疾病[24]、心血管疾病[25]、骨关节炎[26]、糖尿病[27]、自身免疫性疾病[28]，以及各种肿瘤疾病中异常表达。

关于circRNA与肾脏疾病的研究较少，circRNA主要作为miRNA的分子海绵发挥调控作用。Luan等[29]发现，与正常组相比，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)患者肾脏中circHLA-C水平较正常组显著升高，miRNA-150显著下降，并且circHLA-C与miRNA-150呈负相关趋势；此外，在circHLA-C和miRNA-150之间显示了一种完全匹配的结合序列的种子，推测circHLA-C可能是通过调控miRNA-150表达在LN发病机制中发挥重要作用。Hu等[30]在糖尿病模型小鼠和暴露于高糖环境的小鼠系膜细胞中均检测到circRNA_15698表达上调，同时证实circRNA_15698通过充当miRNA-185的分子海绵，调节TGF-β1蛋白的表达，进而促进细胞外基质(ECM)相关的蛋白质合成。

MN与circRNA的相关报道较少。最近一项研究[31]发现，MN患者外周血中circRNA表达与正常人存在差异，其中circ_101319表达明显上调，其可能通过调控miRNA参与了MN相关通路，并且在预测MN方面具有良好的灵敏度和强度，有望成为新的MN诊断标志物，为靶向基因治疗提供新的工具。另外，Ma等[32]的研究证实，与健康对照组相比，IMN患者血清和尿液外泌体中circRNA均存在差异表达，IMN患者血清外泌体中circRNA的种类减少，以内含子区来源为主。其中89个circRNA的表达有显著差异，这些circRNA也大多来源于内含子基因区域，包括上调基因49个，下调基因40个，相应基因主要有SNORA25、SNORA51、SNORA31、SNORA75、SNORD112和其他snoRNA；然而，尿液外泌体中的circRNA种类增加，主要表现为外显子区域来源，60个circRNA的表达具有显著差异，主要属于内含子基因区域，其中54个表达上调，6个表达下调。近55%为内含子来源，30%为外显子来源，15%为基因间区，相应基因主要为SNORA51、SNORA31、SNORA70、SNORA75、SNORD112和其他snoRNA，这些表达异常的circRNA可能参与了IMN的发病机制。

4 总结与展望

总之，ncRNA在MN患者的尿液、血液和肾脏中的异常表达提示其与MN的发病机制相关，又因其表达稳定，为无创检测，可以作为预测MN的新型生物标志物。对ncRNA的表达进行调控也有可能成为治疗MN的新方法。然而，ncRNA参与MN的具体机制仍有待进一步阐明，相信随着对ncRNA的研究逐渐深入，ncRNA将成为诊断与治疗MN的有效工具而造福患者。