甘蓝型油菜早熟性状QTL定位及候选基因筛选

李书宇 黄 杨 熊 洁 丁 戈 陈伦林 宋来强

甘蓝型油菜早熟性状QTL定位及候选基因筛选

李书宇 黄 杨 熊 洁 丁 戈 陈伦林*宋来强

江西省农业科学院作物研究所, 江西南昌 330200

目前对于油菜早熟的研究主要围绕开花期性状进行, 虽然开花期与生育期呈显著正相关, 但却并不完全一致。对于油菜开花后一系列生长发育进程相关性状的遗传研究和QTL定位鲜有报道。本研究以成熟期差异较大的2个油菜品种‘花前早’和‘Global’构建的DH群体为材料, 对影响油菜全生育期的各个发育阶段(开花期、花期持续时间、角果期持续时间和全生育期等)进行表型调查和QTL定位分析。共检测到30个早熟相关性状QTL位点, 其中开花期、花期持续时间、角果期持续时间和全生育期等分别检测到12、5、4和9个QTL位点, 解释了5.8%~22.4%的表型方差。发现4、2和1个全生育期QTL置信区间分别与开花期、花期持续时间、角果期持续时间位点置信区间完全或部分重叠。筛选到29个可能与油菜早熟性状相关的候选基因, 它们通过调控花期或籽粒发育等生长发育进程影响油菜早熟。因此, 在早熟性状的研究中, 可以同时从开花期和籽粒发育过程入手, 不但有利于使熟期进一步提前, 也可减缓早熟油菜品种过早开花导致的冬前低温寒潮天气的不利影响。

甘蓝型油菜; 早熟; QTL作图; 候选基因

油菜是我国重要的油料作物, 菜籽油是城乡居民主要的食用植物油[1-2]。在当前我国植物油自给率持续下降的形势下, 稳定甚至增加国内油菜生产对保障我国食用植物油供给安全具有重要的战略性意义[3]。油菜不与粮食争地, 发展南方700万公顷冬闲田种植油菜是解决这一问题的有效方法[4-5]。早熟对于大多数农作物来说是一个重要的农艺性状, 一方面可解决作物复种中的茬口紧张问题, 提高复种指数, 增加全年作物总产; 另一方面, 在高纬度、高海拔、无霜期短的高寒地区不仅可以充分利用高寒地区的光温资源, 还可避免生育前期低温冷害和生育后期的早霜危害, 从而保证作物的产量和品质, 对作物安全生产具有十分重要的意义[6-7]。油菜早熟性状的遗传解析, 对于早熟油菜品种的选育具有重要的理论与现实意义[8]。

对于油菜早熟性状的研究, 前人主要通过QTL连锁分析或GWAS手段解析其遗传基础[9-12]。Ferreira等[13]首次利用DH群体和含有132个RFLP标记的遗传图谱, 在A9、C2和C6染色体上检测到3个开花期主效QTL, 其中位于A9染色体上的位点表型贡献率达到28%。Long等[14]利用甘蓝型油菜品种TN-DH及其衍生群体, 在11个环境中共检测到42个开花期QTL位点, 其中最大表型贡献率达到52%, 并证实主效区间内基因是油菜开花调控的关键基因。Zhou等利用300份油菜资源和201,817个SNP标记, 对早熟相关性状进行GWAS分析, 检测到131个显著关联的SNP位点, 解释了表型方差的3.27%~13.17%, 此外, 通过单倍型分析和拟南芥同源比对, 筛选得到57个油菜开花期调控基因。Mei等[15]利用早、晚花油菜亲本构建的F2:3家系为材料, 通过2年田间表型考察, 共检测到6个开花期QTL, 解释了表型方差的8.1%~ 30.4%。Xu等[9]利用523份油菜种质资源, 在8个环境下对开花期性状进行全基因组关联分析, 检测到41个显著关联位点, 其表型方差为5.28%~15.75%。截至目前, 在所有19条油菜染色体中均检测到早熟相关性状QTL, 这表明油菜早熟性状具有复杂的遗传基础[16-17]。

目前报道的油菜早熟性状QTL定位主要集中在开花期[18-22], 虽然开花期与生育期呈显著正相关, 但却并不完全一致。开花期可反映开花前生育进程的快慢, 但不能反映开花以后植株生长发育状况。对于油菜开花后一系列生长发育进程相关性状的遗传研究和QTL定位鲜有报道。本研究对影响油菜全生育期的各个发育阶段(开花期、花期持续时间、角果期持续时间)进行研究, 分析各个发育进程的特点及对于油菜早熟形成的影响, 以指导早熟油菜的新品种选育。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用成熟期差异较大的2个油菜品种‘花前早’和‘Global’为亲本, 通过人工杂交获得F1代种子。在初花期对F1植株取样进行小孢子培养, 通过组织培养方法, 小孢子胚进行无菌继代培养, 成苗后移栽至大田。在花期对小孢子苗套袋, 成熟期收获自交种子后即获得该DH群体种子。

1.2 田间试验

2016年10月至2017年5月、2018年10月至2019年5月在江西省农业科学院试验基地(2016南昌, 2018南昌), 2016年10月至2017年4月在韶关市农业科学研究所试验基地(2016韶关), 2018年4月至2019年8月在西宁青海大学试验基地(2018西宁)完成了DH群体种植和早熟性状调查工作。该DH群体共包含184个株系及亲本。田间试验采用完全随机区组设计, 2次重复。每小区种3行, 小区厢宽2.0 m, 行距33.3 cm, 小区面积2.0 m2, 单株间平均间距15 cm。田间管理按当地常规标准实施。

1.3 性状考察和数据分析

参考《油菜种质资源描述规范和数据标准》调查早熟性状, 其中, 全区25%植株开花为开花期标准, 全区75%以上花序完全谢花(花瓣变色, 开始枯萎)为终花期标准, 全区75%以上角果呈枇杷黄色, 或主轴中段角果内种子开始呈现成熟色为成熟期标准。开花期指从播种到初花期所需的天数。开花期至终花期的时间跨度为花期持续时间, 终花期至成熟期的时间跨度为角果期持续时间。

1.4 全基因组重测序

在苗期对DH群体所有株系及亲本取样, 取幼嫩叶片, 采用CTAB法提取DNA。基于Illumina HiSeq平台进行双末端(PE150)测序, 利用cutadapt和trimmomatic软件对测序数据进行质控过滤, 采用BWA软件将测序数据与参考基因组进行比对, 使用Samtools软件和Picard工具进行格式转换和reads排序, 最后使用GATK (v. 3.7)软件进行变异检测以获得SNP变异位点。

1.5 遗传图谱构建与QTL定位

参考Xie等[23]提出的方法进行遗传连锁图谱的构建, 首先, 根据子代群体内标记之间的连锁关系推断亲本的基因型, 并根据亲本基因型将子代基因型转换为A和B, 同时也可以与实际获得的亲本基因型进行比较, 以判断亲本材料的真实性; 其次, 基于隐马尔可夫模型(HMM)填补缺失的基因型, 并对部分错误基因型进行修正; 最后, 根据MSTMap软件描述的方法评估标记之间的重组率, 然后使用Kosambi作图函数计算标记之间的遗传图距。使用QTL Cartographer (v. 1.17)软件进行QTL分析, 分析方法选择的是复合区间作图法, LOD阈值用1000次重复排列测验确定(=0.05)。

1.6 候选基因的筛选

利用甘蓝型油菜基因组ZS11-v20200127 (http:// cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/rape/download_ext), 在QTL置信区间内查询相应的基因序列, 然后与拟南芥基因组序列(https://www.arabidopsis.org/Blast/index. jsp)进行BLAST (参数设置为: e-10), 参考其同源注释, 筛选出与油菜早熟性状相关的候选基因。

2 结果与分析

2.1 亲本和群体表型

亲本‘花前早’和‘Global’早熟各相关性状差异较大,测验结果表明, 所有环境中, 双亲在花期、花期持续时间、全生育期的差异均达到极显著水平(表1)。双亲角果期持续时间的差异在不同环境中表现不同(表1)。DH群体各早熟相关性状在不同年份均呈现广泛的变异, 且在各个环境下都呈正态或近似正态分布(图1), 符合数量性状的典型特征, 适宜采用QTL手段解析其早熟性状的遗传基础。

对上述4个早熟性状进行相关性分析(表2)表明,开花期、花期持续时间、角果期持续时间等性状与全生育期均显著相关, 其相关系数分别为0.926、-0.701和0.158。

表1 亲本和DH群体在4个环境下的早熟相关性状表型

同列中不同大写和小写字母分别表示在0.01和0.05水平上差异达到显著。

Different uppercase and lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

表2 DH群体4个早熟性状的相关性分析

*和**分别表示在0.05和0.01水平上显著相关。

*,**: Significant correlations at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

2016 NC, 2016 SG, 2018 NC和2018 XN分别指2016年南昌, 2016年韶关, 2018年南昌和2018年西宁。

2016 NC, 2016 SG, 2018 NC, and 2018 SG were the code of different environment: 2016 Nanchang, 2016 Shaoguan, 2018 Nanchang and 2018 Xining, respectively.

2.2 遗传图谱构建

经过对测序数据进行质控过滤、BWA比对, 变异检测注释等一系列生物信息分析后, 共获得875,740个变异位点。参考Xie等[23]提出的方法, 筛选出874,995个高质量多态性的SNP标记用于构建遗传连锁图谱。各连锁群长度在62.56~ 206.71 cM之间, 平均长度为136.88 cM。对上述SNP位点进行整合得到3905个Bin。各连锁群Bin数目在140~320之间, 平均数目为206个; 各连锁群上相邻bin之间平均距离在0.42~0.98 cM之间。遗传标记在各连锁群上覆盖密度较高, 且分布较为均匀(表3和图2)。

表3 遗传连锁图谱信息统计表

2.3 多环境下早熟性状QTL定位

利用上述构建好的遗传图谱和DH群体表型数据, 采用QTL Cartographer (v. 1.17)软件对南昌、韶关和西宁2年4个环境下的早熟相关性状分别进行QTL扫描。共检测到30个早熟相关性状QTL位点, 其中开花期、花期持续时间、角果期持续时间和全生育期等分别检测到12、5、4和9个QTL位点, 解释了5.8%~22.4%的表型方差(表4)。其中,和位点可在多个环境中重复检测到。发现4、2和1个全生育期QTL置信区间分别与开花期、花期持续时间、角果期持续时间位点置信区间完全或部分重叠(表4), 表明开花期、花期持续时间、角果期持续时间等各个发育阶段均能影响油菜全生育期, 其中开花期影响最大。

表4 不同环境下检测出的早熟相关性状QTL

FT: 开花期; FPD: 花期持续时间; SPD: 角果期持续时间; FGP: 全生育期。

FT: flowering time; FPD: flowering period duration; SPD: silique period duration; FGP: full growth period.

2.4 候选基因预测

参考甘蓝型油菜基因组ZS11-v20200127, 将30个QTL置信区间内序列和拟南芥的序列进行比对, 分别在A02、A06、A09、C04、C06、C07和C08染色体上的QTL 区间内筛选到29个可能与油菜早熟相关的候选基因(表5)。在开花期QTL区间内, 筛选到12个候选基因, 其中为基因, 介导春化作用, 参与的转录调控。有2个属于基因家族, 在花分生组织活动中起着核心作用。的拟南芥同源基因影响mRNA加工, 参与开花时间的调控。的拟南芥同源基因为一年生冬性拟南芥延迟开花所必需。在花期持续时间QTL区间内, 筛选到的5个候选基因、S、、和分别与拟南芥、、、和同源, 其中直接参与开花时间调控,在花分生组织维持中起作用,参与花的发育, 光形态发生,参与花的发育, 对生长素刺激的响应和果实的发育等,为基因家族的成员, 编码SCL13蛋白质。在角果期持续时间QTL区间内, 筛选到8个候选基因, 有2个候选基因与生长素调控响应相关, 3个候选基因与光合作用及光敏性相关, 2个候选基因编码LEA家族蛋白, 与胚胎晚期发育有关, 1个候选基因编码ENTH/ANTH/VHS超家族蛋白。在全生育期QTL区间内, 筛选到4个候选基因。其中,为基因, 参与调控植物从胚发生到花形成过程, 在乙烯介导的信号传导中起关键作用。编码MADS box家族转录因子, 参与调控根细胞分化和开花时间。编码MIKC家族转录调控因子, 参与花粉发育。为基因, 参与昼夜节律。

3 讨论

3.1 油菜遗传图谱构建

分子遗传图谱是进行油菜重要性状QTL定位和基因克隆的基础。早在1991年, Landry等[24]就利用103个RFLP标记, 构建了首张甘蓝型油菜遗传连锁图谱, 此后国内外实验室陆续发布了多张遗传图谱, 但普遍存在密度较低和标记分布不均匀等问题, 这限制了QTL定位的效率和精度。近年来, 分子生物学技术的高速发展极大地推动了油菜高密度遗传图谱的构建。Shi等[25]利用1038个标记和BnaZN F2群体, 构建了一张长度为1763.2 cM的高密度遗传图谱, 其相邻标记距离在1.45~4.01 cM之间, 平均2.19 cM。基于SNP芯片技术, Liu等[26]利用9164个SNP标记和RIL群体, 构建了长度为1832. 9 cM的油菜高密度遗传图谱, 其相邻标记平均距离为0.66 cM, 分辨率大大提高。俎峰等[27]利用甘蓝型油菜60K SNP芯片(Illumina Infinium HD Assay)技术构建的高密度遗传连锁图长度为3838.2 cM, 包含7601个SNP位点。目前报道的高密度遗传连锁图大多采用甘蓝型油菜60K SNP芯片(Illumina Infinium HD Assay)或简化基因组测序技术。本研究利用全基因组重测序筛选出874,995个SNP标记构建高质量遗传连锁图谱, 各连锁群上相邻bin之间平均距离在0.42~0.98 cM之间。遗传标记覆盖密度较高, 且分布较为均匀。基于全基因组重测序技术构建的遗传连锁图谱质量较传统分子标记、芯片或简化基因组测序技术手段获得的遗传图谱更具优势。

3.2 不同发育阶段与全生育期的相关性

全生育期是油菜早熟性状鉴定的主要指标, 由于开花期与全生育期高度正相关, 对于油菜早熟性状的研究及品种选育等工作主要围绕开花期性状进行研究[28-31]。俎峰等[27]认为, 生育期比开花期遗传更复杂, 在其QTL定位研究中需尽可能分解性状, 量化性状判定指标, 从而降低生育期的遗传复杂度, 有利于检测出稳定的遗传位点。本研究对影响油菜全生育期的各个发育阶段(开花期、花期持续时间、角果期持续时间等)进行表型调查和QTL定位分析。各发育阶段的田间表型和QTL定位结果均表明, 它们与全生育期密切相关。其中, 开花期、花期持续时间、角果期持续时间与全生育期的皮尔森相关系数分别为0.926、-0.701和0.158, 相关性均达到显著水平。在检测到9个全生育期QTL位点中, 发现4、2和1个全生育期QTL置信区间分别与开花期、花期持续时间、角果期持续时间位点置信区间完全或部分重叠。以上结果表明, 虽然开花期是早熟性状选择的重要指标, 但开花后的一系列生命活动也参与了油菜的生殖生长发育进程, 与全生育期显著相关。因此, 在早熟性状的研究中, 可以从各个发育阶段入手, 不但有利于使熟期进一步提前, 也可减缓早熟油菜品种过早开花导致的冬前低温寒潮天气的不利影响。

3.3 候选基因筛选

对模式植物拟南芥早熟相关基因的研究主要集中在开花期性状[32-33], 其遗传调控网络的研究表明, 主要有以下几种途径参与开花调控, 分别是春化、光周期、赤霉素、自主途径和年龄等, 涉及100多个基因参与[34-37]。对于油菜早熟相关基因的研究, 也有开花基因被成功克隆的报道[38-41]。Chen等[42]克隆得到油菜开花基因, 并研究其花期调控机制。Hou等[43]克隆出甘蓝型油菜基因, 该基因是调控油菜冬春分化的关键因子, 其表达受春化作用的抑制。本研究在油菜早熟性状QTL置信区间内筛选到29个早熟相关基因, 它们主要参与开花调控、花序分生组织活动、春化、光形态建成及生长素响应等生物学过程。其中, 开花期、花期持续时间QTL置信区间内筛选到的候选基因主要影响开花过程, 例如在C08染色体上筛选到的候选基因其拟南芥同源基因介导春化作用, 参与了的转录调控。编码一种核定位锌指蛋白。在野生型拟南芥中, 春化导致开花抑制因子水平的稳定下降。在突变体中, 虽然的表达在春化过程中正常下调, 但当植物恢复到正常温度时,mRNA的水平会上升[44]。在A02染色体上筛选到的候选基因, 其拟南芥同源基因与bHLH转录因子结合形成异二聚体并负向调控其表达, 直接受和基因的负调控, 为开花期调控所必须[45]。油菜开花受精后, 籽粒发育过程是影响油菜产量、品质、成熟期等性状的关键。对水稻、小麦等作物籽粒灌浆过程的研究表明, 大粒品种和高产品种的籽粒均具有灌浆速率快和灌浆时间长的特点[46]。而在角果持续时间QTL置信区间内筛选到的候选基因主要影响籽粒发育过程。例如, 在A09染色体上的, 其拟南芥同源基因为生长素调控基因, 参与籽粒发育。Hu等[47]发现, 受生长素诱导的基因在拟南芥器官发育过程中能够通过改变细胞数量, 延长生长发育时间等方式调控籽粒发育。在C08染色体上的, 其拟南芥同源基因编码LEA家族蛋白, LEA蛋白及其mRNA主要在籽粒发育晚期大量积累, 主要参与应答植物失水胁迫, 与籽粒发育密切相关[48], 其对籽粒发育时间的具体影响还有待进一步研究。

4 结论

田间表型和QTL定位结果均表明, 开花期、花期持续时间、角果期持续时间等与全生育期密切相关。筛选到的29个候选基因通过调控花期或籽粒发育等生长发育进程影响油菜早熟。因此, 油菜早熟性状的研究可同时考虑开花和籽粒发育过程。以上工作为油菜早熟性状的遗传改良提供了新的思路。

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QTL mapping and candidate genes screening of earliness traits inL.

LI Shu-Yu, HUANG Yang, XIONG Jie, DING Ge, CHEN Lun-Lin*, and SONG Lai-Qiang

Institute of Crops, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, Jiangxi, China

Currently, the research on earliness traits of rapeseed mainly focused on flowering time. Although there was a significant positive correlation between the flowering period and the growth period, it was not completely consistent. There are few reports on the genetic studies and QTL mapping of traits related to rapeseed growth and development after flowering. We carried out phenotypic survey (flowering time, flowering period duration, silique period duration etc.) and QTL mapping with the DH population constructed by ‘Huaqianzao’ and ‘Global’ as material. A total of 30 QTL loci for earliness traits were detected. Among them, 12, 5, 4 and 9 QTL loci were detected in the flowering time, flowering period duration, silique period duration and full growth period, respectively, explaining 5.8%–22.4% phenotypic variance. The 2, 4, and 1 QTL confidence intervals of full growth period were found overlap in part or in whole with flowering time, flowering period duration and silique period duration respectively. The 29 candidate genes were screened, which affected the earliness traits by regulating flowering or silique development in rapeseed growth and development processes. Therefore, in the study of earliness traits, we could consider flowering time and silique development process at the same time, which not only helps to advance the maturity period, but also reduces the adverse effects of early flowering.

L.; earliness traits; QTL mapping; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2021.04145

本研究由国家自然科学基金项目(31660403), 国家重点研发计划项目(2017YFD0101703)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-12)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660403), the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101703), and the China Agriculture Research System (CARS-12).

陈伦林, E-mail: lunlinchen@163.com

E-mail: lishuyu0104@163.com

2020-07-02;

2020-10-14;

2020-11-11.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20201111.1038.002.html