多囊卵巢综合征与THADA基因多态性研究

帕孜力亚·牙生 姚 华 占 琼 赵 静

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种高度流行的内分泌疾病和妇科疾病，伴有月经不规律、不孕、肥胖、多毛、痤疮和血生化水平异常等症状[1～3]。据统计，全球18～44岁的女性PCOS的发生率为5%～20%，且呈逐年上升趋势[4，5]。许多研究表明遗传因素与PCOS的病因有密切关系，经过2期PCOS的全基因组相关性研究(genome-wide association studies，GWAS)发现了11个PCOS的易感位点与17个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)[6]，其中包括甲状腺腺瘤相关蛋白THADA基因。

甲状腺激素主要参与能量代谢，若甲状腺功能障碍会干扰能量代谢[7]。THADA编码在肾上腺髓质、肾上腺皮质、甲状腺、胰腺、睾丸、胸腺、小肠和胃中表达的甲状腺腺瘤相关蛋白，与能量代谢紊乱有关。研究表明，THADA基因可能通过减少能量产生并增加肥胖易感性影响PCOS的风险[7,8]。但是，确切病因仍未完全阐明。因此本研究旨在分析可能与PCOS发生相关的THADA基因多态性，为PCOS的诊断和病因学研究提供依据，为制定预防PCOS的措施奠定基础。

材料与方法

1.研究对象：经笔者医院医学伦理学委员会审核通过后，收集2018年4月～2019年10月在新疆医科大学第一附属医院妇科门诊做备孕检查的健康备孕女性166例和同期同院生殖助孕中心的PCOS确诊患者166例临床资料及全血标本，用iMLDR技术检测THADA基因多态性。两组女性年龄控制在20～35岁且均已签署知情同意书，并排除合并糖尿病等内分泌疾病、其他妇科疾病、合并感染者。

2.研究方法：主要包括以下两方面：(1)通过病历查阅的方式收集两组女性实验室检测指标：抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estrodiol，E2)、空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)。(2)两组女性在静息空腹状态下自前臂肘正中静脉取4ml血，用全血基因组DNA快速提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，离心柱型]提取DNA并用超微量分光光度计进行定量，检测DNA浓度。根据相关文献以及利用国际HapMap数据库中的中国人群基因组SNPs基因型信息(CHB)，挑选与PCOS相关的THADA基因3个位点，分别为rs12468394、rs13429458和rs7563201。根据目标位点设计引物(上海生工生物工程有限公司提供，表1)，进行多重PCR反应。采用改良多重高温连接酶反应(improve multiplex ligasedetection reaction，iMLDR)技术测定基因型。

表1 PCR引物序列

3.统计学方法：采用SPSS 22.0统计学软件和SHEsis软件对数据进行统计分析，所有研究对象进行基因位点的Hardy-Weinberg遗传平衡检验。PCOS组和对照组基因型和等位基因频率的变量组间比较采用χ2检验，通过Logistic回归衡量两组基因组分布及等位基因频率的关联强度。随后用单因素方差分析去比较所研究的PCOS相关临床指标与相关基因位点的多种基因型。

结 果

1.THADA基因位点的Hardy-Weinberg遗传平衡性检验：经Hardy-Weinberg遗传平衡检验显示，THADA基因的基因型频率分布均符合平衡定律 (P均>0.05)，而且，所选位点遗传标记在人群中的最小等位基因频率(MAF)≥5%，由此提示，本次研究样本来自一个稳定的群体，收集的样本具有较好的代表性，详见表2。

表2 Hardy-Weinberg遗传平衡性检验

2.THADA基因各基因型和等位基因频率的分布比较：分析PCOS组和对照组各位点的基因型及基因频率的分布，对等位基因进行OR值和95%CI的计算，分析比较不同等位基因的分布与PCOS发生的关联。THADA基因各位点的基因型和等位基因在两组女性中差异无统计学意义(P>0.05)。对各位点的等位基因纳入单因素Logistic回归分析中，发现各位点OR值的95%CI均包含1，尚不能认为不同等位基因是PCOS的危险因素，详见表3。

表3 PCOS组和对照组各位点基因型及等位基因频率分布的结果[n(%)]

3.THADA基因在不同遗传模型中基因突变与PCOS易感性分析：进一步构建模型分析THADA基因多态性与PCOS易感性进行关联分析，THADA基因3个位点在不同模型下两组间比较，差异无统计学意义，详见表4。

4.3个基因位点多态性与临床指标之间的联系：对两组女性进行THADA基因各位点与临床指标之间的关联性分析，发现PCOS组中E2在rs12468394位点CC、AC、AA 3个基因型间比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组中E2在THADA基因rs13429458位点AA、CA、CC 3个基因型间比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表5～表7。

5.3个基因位点的连锁不平衡分析：采用SHEsis软件分析THADA基因3个位点的连锁不平衡，按规定，当D′>0.8和r2>0.33时代表所分析的两位点连锁不平衡，D′值和r2值越接近于1，说明其连锁越明显[9]。检验结果如表8和图1所示，THADA基因rs12468394位点与rs13429458位点、rs12468394位点与rs7563201位点、rs13429458位点与rs7563201位点间均具有较强的连锁不平衡(D′≥0.85)。基于上述构建单倍体型满足单倍体型频率>0.03的条件时THADA基因Block 可形成3种单倍型。经分析，THADA基因的各单倍体型与PCOS发生风险未观察到明显统计学关联(P>0.05，95%CI包含1)，详见表9。

讨 论

PCOS是临床上常见的妇科及内分泌科疾病，近年来，虽然大量PCOS相关研究对于PCOS的诊治工作做出了重大贡献，但PCOS的发生率在世界范围内仍呈现逐年上升的趋势，其中各国报道的育龄期女性PCOS发生率为5%～20%[2]。我国育龄期女性PCOS发生率为5.6%[10]。因此，PCOS的研究依然是内分泌及妇科学术界的热点。目前关于PCOS的发生机制尚未完全阐明，大量研究资料显示，PCOS的发生是多种因素综合作用的结果，包括环境因素以及遗传因素，遗传因素是多因素变异累积的过程，涉及多种基因异常[11～13]。

THADA基因，也称甲状腺腺瘤相关蛋白，位于2号染色体短臂2p21，首次发现于甲状腺瘤。THADA的遗传变异可能改变能量消耗并导致体重增加，肥胖会增加胰岛素抵抗。因此，THADA基因变异可能通过胰岛素抵抗增加PCOS风险[6]。Ⅱ期GWAS研究结果显示THADA基因rs12468394、rs13429458、rs12478601与汉族女性PCOS发病有关[14]。随后一项家系研究进一步证实了rs13429458与PCOS的关系[15]。国外一项针对欧美人的研究中rs12468394也得到了验证，但提示rs13429458、rs12478601并无关联。Louwers等[16]进行的Meta分析显示，rs12468394、rs12478601位点与PCOS易感性有一定的关系，rs13429458与之无关。由于众多研究结果不一致，因此本研究也分析THADA基因rs12468394、rs13429458及rs7563201位点，但以上3个位点在PCOS和对照组女性中比较,差异无统计学意义(P>0.05)。对其进行进一步的分析，在3种模型下分析其与PCOS的关联性，仍未发现SNP位点的显著差异性，因此未得出THADA基因多态性是PCOS的危险因素或保护因素的结论。得出上述结论的可能原因是这些位点与PCOS发生风险存在微效作用，而本次研究由于样本数量不够多，导致其检验效能不够强；但也有可能是这些位点的确与PCOS发生不相关。

表4 不同模型中PCOS组与对照组各基因多态性的关联性分析[n(%)]

表5 THADA基因rs12468394位点各基因型与PCOS相关因素分析[M(Q1，Q3)]

表6 THADA基因rs13429548位点各基因型与PCOS相关因素分析[M(Q1，Q3)]

表7 THADA基因rs7563201位点各基因型与PCOS相关因素分析[M(Q1，Q3)]

表8 PCOS组和对照组THADA基因多态性 位点连锁不平衡检验

图1 THADA基因多态性各位点连锁不平衡检验 左侧为D′检验，右侧为r2检验

表9 THADA基因构建的单倍体型在PCOS组和对照组中的分布[n(%)]

既往基因型-表型研究表明，THADA基因与脂代谢和LH、T分泌关系密切， 对PCOS临床特点的改变有一定的影响，且与卵巢多囊改变的表型有关[17]。故本研究进一步在THADA基因rs12468394、rs13429458、rs7563201这3个位点的不同基因型下分析两组女性临床检测指标的差异，在PCOS组中rs12468394位点杂合子突变CA型的E2水平低于野生型纯合子CC型，且差异均有统计学意义(P<0.05)，而对照组中刚好相反。分析其原因可能是该位点突变有可能会影响下丘脑-垂体-卵巢轴调节功能，使E2水平降低，但具体机制还需要进一步分析。

本研究也具有一定的局限性，本研究为单中心研究，且样本例数偏少，可能出现患者的选择偏倚，而且在分析相关基因型与疾病关联时出现个别基因型未检测的现象，导致这种现象的原因可能是样本量不足所引起的偏倚。因此笔者将在后续入选病例中，完善实验设计，补充样本量，对PCOS相关因素及机制进行更全面、深入的研究。