子痫前期孕妇血清维生素D水平与维生素D受体基因多态性的相关性

李祥雯 李 晶 朱启英

子痫前期(preeclampsia, PE)是特发于人类的以孕期血压升高、并导致一系列母胎并发症为特征的妊娠期特有疾病。在全球范围内的发生率约占孕妇总数的5%～10%[1]。在我国，随着二胎政策的全面放开，PE的发生率也逐渐升高。PE的发生、发展涉及多种因素，近年来流行病学研究及临床研究均提示孕期血清维生素D(vitamin D，VD)水平低下是PE的相关因素[2～4]。VD受体(VDR)是类固醇激素/甲状腺激素受体超家族的成员，人类几乎所有的组织和细胞中都发现存在 VDR，强调VDR可广泛调节全身组织和细胞的功能[5]。VDR由一个巨大的基因(> 100kb)编码，每一种基因变体如果出现在至少1%的人群中，就称为多态性[6]。VDR基因具有4个精确描述的双等位基因多态性，即BsmI (A>G)、ApaI (A>C)、FokI (C>T)和TaqI (T>C)。VDR等位基因变异和受体的不同表达在许多健康问题中起着关键作用，如乳腺癌或自身免疫性疾病[7,8]。但VDR及其等位基因变异，特别是不同维生素D水平下在子痫前期发生上的作用尚未明确。为此笔者医院进行了一项对照研究，报告如下。

资料与方法

1.临床资料：纳入标准：①孕周20～28周；②均规律产检；③均符合中华医学会妇产科学分会妊娠期高血压疾病学组制定的《妊娠期高血压疾病诊治指南(2015)》中关于子痫前期的诊断标准[9]；④临床资料完整；⑤均为单胎妊娠。排除标准：①存在器质性疾病、免疫系统疾病、血液病等基础疾病者；②多胎妊娠；③妊娠期甲状腺功能减退或甲状腺功能亢进者；④合并慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病及肝病病史，输血、免疫治疗史的孕妇。共纳入2018年2月～2019年4月新疆医科大学第一附属医院收治的子痫前期孕妇100例，设为PE组；另选取同期健康规律产检孕妇100例，设为对照组。

2.收集指标：通过病历回顾孕早期两组孕妇的基本临床资料，包括年龄、孕周、BMI、收缩压、舒张压，肝功能指标[谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、直接胆红素(Db)、间接胆红素(Tb)、白蛋白(Alb)]、血清甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)及1,25(OH)2D3、钙离子水平。

3.VDR基因多态性检测：采集所有受试者的外周血5ml，采用Bioteke DNA提取试剂盒[中国江苏无锡百泰克生物技术有限公司，批准文号：沪食药监械(准)字2014第1400585号]提取DNA，分光光度仪测定DNA的浓度及纯度，并置于-20℃冰箱中保存备用。维生素D受体基因BsmI、FokI、TaqI、ApaI的单核苷酸多态性采用 TaqMan 系统和 ABI7900HT RT-PCR 仪器(美国Life Technologies公司)进行测量。采用Apaman探针实时荧光PCR技术检4个位点的基因型，引物由美国Applied Bio 生物科技公司设计研发，Apa位点的上游引物序列为5′-ACCCATAATAAGAAATAGTTTTA-3′，下游引物序列为5′-TGTGACCTAGTTTAC-3′；FokI位点的上游引物序列为5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′，下游引物序列为5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′。TaqI位点的上游引物序列为5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′，下游引物序列为5′-GGATGTACGTCTGCAGTGTG-3′；BmsI位点的上游引物序列为5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCATGA-3′，下游引物序列为5′-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3′。PCR采用25μl反应体系，扩增条件为95℃预变性3min，95℃15s，60℃1min，共45个循环，扩增结束后采用Bio-Rad C FX manager 3.0 软件进行基因型分析。

结 果

1.PE和对照组孕妇一般资料比较：PE组孕妇血清1,25(OH)2D3、血钙及白蛋白水平低于对照组，甘油三酯水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 两组孕妇一般资料比较

2.两组孕妇VDR基因多态性比较:两组孕妇VDR基因4个位点的基因型、等位基因频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表2 两组孕妇VDR基因多态性比较

3.两组中低1,25(OH)2D3水平的孕妇间VDR基因多态性比较：PE组VDR基因位点中BsmI GG基因型、G等位基因频率及ForI CC基因型、C等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表3 两组低1,25(OH)2D3水平的孕妇间VDR基因多态性比较

3.两组正常1,25(OH)2D3水平的孕妇间VDR基因多态性比较:PE组与对照组各VDR基因位点的基因型及等位基因频率情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表4。

表4 两组正常1,25(OH)2D3水平的孕妇间VDR基因多态性比较

讨 论

PE通常表现为孕20周以后出现的血压升高，但研究显示，PE的发生起始基础是早孕期胚胎着床和胎盘形成不良，引起胎盘局部缺血缺氧、炎症和免疫调控网络失衡，释放各种因子，引起全身小血管痉挛[10]。多项研究显示,孕期血清维生素水平低下是PE的高危因素，孕早期维生素D缺乏可增加早发型PE的发病风险。临床研究显示，约40%～62%的女性在孕早期血清内存在维生素D缺乏，这就可能增加PE的发生风险[11]。维生素D能够广泛调节全身组织和细胞功能，除了直接调节钙磷骨代谢外，对于免疫系统、心血管系统也具有一定的作用。维生素D参与上述调节需要细胞膜上的VDR参与，VDR广泛存在于全身各组织细胞中，妊娠期子宫内膜基质细胞和妊娠早期蛻膜细胞等多种生物组织细胞中均有VDR的表达。还有研究表明，VDR及VDR信号途径在胎盘中具有重要作用，子痫前期患者胎盘组织中VDR表达水平低可能与子痫前期发生有关[12]。VDR调节异常可能是低水平1,25(OH)2D3参与PE形成的关键原因，也是机制研究的一个切入点；但目前国内外尚未见有1,25(OH)2D3降低PE发生的机制研究。维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)是由VDR基因编码，VDR基因位于12号染色体长臂1区3带，全长75kb，由9个外显子和8个内含子组成，包含有多个单核苷酸多态性位点， VDR基因多态性是指每种基因多态性位点出现在至少1%的人群中就称为该基因的多态性[13]。常见的VDR多态性位点为rsl544410、rs7975232、rs731236以及rs2228570双等位基因位点，而这些等位基因的变异进而导致其受体呈现不同表达，对于许多疾病的发展起着重要作用，但在妊娠期的作用特别是对于子痫前期发生风险的机制尚不明确[14]。

本研究的维生素D水平与国内其他学者研究的新疆地区的维生素D水平相类似，均低于中东部地区人群[15]。另外VDR受体多态性也与国内关于新疆地区人群中VDR的研究类似[16]。新疆地区孕妇的子痫前期发生率也高于中东部地区，可能与人种和新疆地区居民的饮食结构有关[17]。

在本研究中，PE组孕妇血清1,25(OH)2D3、血钙及白蛋白水平低于对照组，甘油三酯水平高于对照组，分析认为，子痫前期孕妇体内存在多种物质代谢紊乱，特别是脂代谢紊乱和胰岛素代谢异常，国外文献也报道了相同的结论[18]。维生素D在体内的活性形式为1,25(OH)2D3，通过与VDR结合发挥生物学效应，包括调节钙磷骨代谢和相关蛋白的合成等。国内有研究者利用前瞻性队列分析显示，超过2/3的重度子痫前期患者处于维生素D缺乏或不足的状况，其血清1,25(OH)2D3水平于妊娠第6～10周就明显低于正常妊娠者[19]。在妊娠期VD通过与VDR结合参与胚胎着床、调节妊娠相关蛋白合成、调节细胞因子的合成及钙的输送，对于维持正常妊娠和胎儿生长发育发挥着重要作用。

进一步分析VDR基因的多态性，25(OH)2D3水平低的PE组VDR基因位点中BsmI GG基因型、G等位基因频率及ForI CC基因型、C等位基因频率高于对照组；但1,25(OH)2D3水平正常的PE组和对照组之间各基因位点差异无统计学意义，这提示VDR基因多态性影响血清维生素D水平的高低，也影响PE的发病风险。分析上述现象，VDR基因多态性可能会影响VDR基因的表达和功能，并可能影响1,25(OH)2D3与VDR的结合。有研究指出，BsmI位点的多态性会影响钙的吸收及VDR在小肠上皮细胞的表达，进一步影响VD的吸收[20]。

正常水平的血清维生素D可以通过抑制RAS来预防高血压。同样，维生素D可以通过抑制血管平滑肌细胞增殖来影响血压，维生素D含量过低可能会增强肾素分泌，与血管平滑肌细胞增殖有关的机制可能是子痫前期的发病一个潜在因素。已发现FokI和BsmI的常见VDR多态性与妊娠外高血压风险之间有很强的联系，另外，有关于克罗恩病和VDR基因多态性关系的研究发现，ForI位点的基因突变能够影响克罗恩病的严重程度，VD与相应的受体结合增强了局部的炎性反应有关[21]。而1,25(OH)2D3低下的PE患者ForI位点CC基因型、C等位基因频率较高，这些突变基因型的VDR受体在于VD结合后有可能增加胎盘及子宫内血管壁的炎症，增加了PE的发病风险。

综上所述，子痫前期孕妇体内1,25(OH)2D3水平较低，这种低水平的状态可能与维生素D受体基因位点BsmI和ForI多态性有关；低1,25(OH)2D3水平且BsmI位点GG基因型及ForI位点CC基因型比例较高的孕妇易发生子痫前期。