抑制TLR4对急性呼吸窘迫综合征小鼠的保护作用及机制研究

姜 芸 郭 红

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一种危及生命的呼吸系统疾病，是危重症医学中最具有挑战性的临床疾病之一。它是由创伤、炎症、脓毒血症等各种肺内、外致病因素所引发的急性呼吸衰竭[1]。ARDS引起的病死率高达40%～60%[2，3]。目前，ARDS发病机制尚不明确，但是已有研究表明，其病理过程与炎性反应密切相关，肺组织出现严重的炎性反应，TNF-α、IL-6等炎性因子大量释放，并且伴随炎性细胞在肺部的大量聚集而进一步加重肺组织损伤。已有研究表明，抑制炎性因子的释放能够有效缓解ARDS[4，5]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)是一类与炎性反应密切相关的细胞膜受体，当其与LPS等配体结合后可激活下游NF-κB信号通路，进而促进炎性因子的释放，TAK242作为TLR4抑制剂，能够抑制TLR4的表达[6]。本研究通过使用TAK242抑制TLR4观察对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性呼吸窘迫综合征的影响及机制，旨在为ARDS临床治疗和研究提供帮助。

材料与方法

1.材料：6周龄雄性BALB/c小鼠45只，体质量20～25g,购自新疆医科大学动物实验中心，饲养及实验取材过程中严格遵守实验动物伦理保护等相关规定；LPS购自美国Sigma公司；TAK242购自美国MedChemExpress公司；TLR4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、NF-κB一抗购自沈阳万类生物科技有限公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自福麦斯生物技术有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自乌鲁木齐熬锐东源生物科技有限公司；血气分析仪ABL90购自丹麦Radiometer公司。

2.动物分组及造模：45只BALB/c小鼠随机分为3组，分别为对照组、模型组(ARDS组)和TLR4抑制剂TAK242组(TAK242组)。ARDS组和TAK242组小鼠分别尾静脉注射5ng/g的LPS诱导小鼠产生脓毒血症，制备脓毒血症性急性肺损伤模型，对照组小鼠注射等体积的0.9%氯化纳注射液，TAK242组小鼠造模的同时给予5ng/g TAK242。

3.行动脉血气分析：给药治疗结束后，各组小鼠麻醉成功后，暴露腹主动脉，用经肝素润洗的1ml一次性注射器抽出动脉血约0.3ml，使用血气分析仪行血气分析，比较PaO2/FiO2。

4.ELISA检测血清炎性因子TNF-α、IL-6水平：给药结束后，各组小鼠麻醉后，开胸取腹主动脉300μl全血，室温静置4h后，3500r/min、4℃离心15min，分离上层血清，按照ELISA试剂盒检测方法分别测定血清TNF-α、IL-6含量。

5.HE染色:实验完成后，各组小鼠解剖取肺组织于组织固定液中固定，制作肺组织石蜡切片进行染色，于光学显微镜下观察，并拍照记录。

6.免疫组化:实验结束后，各组小鼠解剖取肺组织于组织固定液中固定24h，石蜡包埋后制备石蜡切片，然后置于二甲苯中脱蜡，依次经乙醇和蒸馏水中复水；使用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，经BSA封闭后一抗孵育过夜，清洗后二抗孵育，然后切片用苏木精复染，使用中性树脂封片后于显微镜下观察。应用IPP 图像分析软件测定小鼠肺组织各蛋白表达的平均吸光密度值来进行分析。

7.Western blot法检测TLR4、NF-κB蛋白表达:取各组小鼠肺组织50mg，加入100ml RIPA蛋白裂解液，使用匀浆机于冰上匀浆，匀浆液 12000r/min离心15min，取上清即为组织总蛋白；BCA蛋白定量后样品煮沸变性；然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对PVDF膜封闭2h，然后以1∶1000比例稀释后的TLR4、NF-κB一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应30s，曝光并拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

结 果

1.各组小鼠行血气分析检测结果：与对照组比较，ARDS组小鼠PaO2/FiO2值显著降低(452.00±9.54 vs 263.30±21.63,P<0.05)；与ARDS组比较，TAK242组小鼠PaO2/FiO2值显著增加(263.30±21.63 vs 308.12±13.53,P<0.05)。

2.血清炎性因子TNF-α、IL-6水平：与对照组比较，ARDS组小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.05)；与ARDS组比较，TAK242组小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05，表1)。

表1 各组小鼠血清TNF-α、IL-6水平比较

3.小鼠肺组织病变:HE染色检测结果显示，对照组小鼠肺组织肺泡结构完整，组织细胞排列整齐，没有出现出血以及炎性细胞的浸润，没有病理损伤；ARDS组小鼠肺组织出现弥散性肺损伤，肺泡壁损伤严重，肺间质严重增宽，出现红细胞露出，炎性细胞浸润明显，肺组织损伤严重，说明ARDS造模成功；TAK242组小鼠肺组织损伤程度较弱，肺泡结构相对完整，炎性浸润较ARDS组显著减少，提示TAK242能够缓解ARDS小鼠肺组织损伤(图1)。

4.免疫组化检测各组小鼠肺组织TNF-α、IL-6表达：ARDS组小鼠肺组织TNF-α、IL-6表达高于对照组，而TAK242组小鼠肺组织TNF-α、IL-6表达低于ARDS组(图2，表2)。

5.Western blot法检测各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达：与对照组比较，ARDS组小鼠肺组织TLR4、NF-κB表达水平均显著升高(P<0.05)。与ARDS组比较，TAK242治疗组小鼠TLR4、NF-κB表达水平均显著下调(P<0.05,图3)。

图2 免疫组化检测各组小鼠TNF-α、 IL-6表达结果(×200)

表2 各组小鼠肺组织TNF-α、IL-6表达的 平均光密度统计

图3 各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平 与对照组比较，*P<0.05；与ARDS组比较，#P<0.05

讨 论

研究表明，ARDS的主要病理特征为肺组织中蛋白质类液体累积，炎性反应暴发浸润肺部，威胁患者的生命[7]。现阶段临床常采用机械通气治疗以及非机械治疗，但治疗效果并不理想。因此，控制炎性反应、探究新型有效的抗炎治疗药物对于ARDS的临床治疗亦至关重要[8～10]。Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子并激活机体产生免疫细胞应答，对病原微生物感染早期的特异性识别及介导炎性反应具有十分重要的意义[11,12]。

另一方面，LPS是由免疫活性宿主中的细菌所产生的，可以在体内外引起强烈的炎性级联反应，并且在体内可诱发感染，进而引起肺组织严重的炎性反应[13]。TLR4可以通过识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(heat-shock proteins，HSP)等促进内源性酶的级联活化反应，激活下游NF-κB信号通路，促进TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、趋化因子、黏附分子、集落刺激因子等细胞因子的释放，介导体内炎症暴发[14]。本研究通过LPS诱导了小鼠急性呼吸窘迫综合征模型，旨在探究TAK242作为TLR4的选择性的信号转导抑制剂对ARDS小鼠的治疗作用及机制。结果表明， TAK242能够显著增加ARDS小鼠氧合指数，改善ARDS小鼠血氧水平，并且降低血清炎性因子TNF-α、IL-6水平，缓解体内炎性反应。病理切片检测结果显示，TAK242能够显著改善ARDS小鼠肺组织损伤，以及肺组织TNF-α、IL-6表达水平，并且抑制ARDS小鼠肺组织TLR4及NF-κB表达，说明TAK242抑制TLR4表达而抑制NF-κB信号通路进而缓解小鼠ARDS。

综上所述，TAK242能够通过阻断TLR4抑制小鼠ARDS炎性因子表达，进而抑制下游NF-κB信号通路及炎性反应，发挥对ARDS小鼠的治疗作用。