基于线粒体D-loop区和Cyt b基因分析广西禾花鲤三个群体遗传结构

程 磊 何苹萍 韦嫔媛 鲁翠云 吴铁军 彭金霞

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所农业农村部水产生物技术与遗传育种重点实验室,哈尔滨 150070;2.广西水产科学研究院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,南宁 530021)

鲤(Cyprinus carpio)养殖历史悠久,至今仍是许多国家的重要水产养殖对象[1,2]。目前,鲤在中国的年养殖产量约3×109kg,是产量第四位的水产养殖品种[3]。鲤经历了长期的养殖和选育,形成许多极具特色的品种或品系,如现在广泛养殖的镜鲤、建鲤、荷包红鲤等[4,5]。中国南方地区有在稻田中养殖鲤的传统,形成独特的“稻鱼共作”文化,其中浙江省青田县的“稻鱼共生系统”于2005年6月被联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)列为首批全球重要农业文化遗产(Globally Important Agricultural Heritage Systems,GIAHS),是我国的第一个该类型项目[6]。

在广西壮族自治区的西北部,稻田养殖禾花鲤(又名禾花鱼)的历史也已经有上千年,是最具广西地方特色的“稻鱼共作”品种。禾花鲤(Cyprinus carpio)体型粗短、鳞细皮薄、肉质细嫩、味道鲜美,因食稻田禾花而得名,清代乾隆年间曾成为宫廷贡品,现在也深受当地居民和游客的青睐[7]。广西壮族自治区西北部经济社会发展相对滞后,少数民族人口众多,是扶贫攻坚战中任务最重的地区之一。禾花鲤价格高于普通淡水鱼,在当地有较好的养殖传统和基础,发展禾花鲤“稻鱼共作”生态养殖是实现农业增效、农民增收和山区精准脱贫的有效途径之一。

鲤在欧亚大陆有广泛的分布,《中国鲤科鱼类志》记载中国分布有4个鲤亚种:西鲤(Cyprinus carpio carpio),分布于中亚与欧洲的广大地区,在中国仅见于新疆;远东鲤(Cyprinus carpio haematopterus),分布区北至黑龙江,南至闽江;华南鲤(Cyprinus carpio rubrefusus),则分布于珠江、沅江、海南岛等地[8];杞麓鲤(Cyprinus chilia),仅分布于我国云南省的一些湖泊中。杞麓鲤与其他三个亚种差异较大,现在已被视为一个有效物种[9]。不难发现,广西禾花鲤的传统养殖区恰好是鲤与华南鲤分布区的交汇处[10]。

长期以来对于禾花鲤的种质资源状况缺乏研究,至今仍然有相当一部分科研人员将禾花鲤归入原鲤属(Procyprinus)[11—13],种质资源不清已经成为广西禾花鲤保护利用及相关产业发展的重要制约因素。鱼类线粒体DNA结构紧凑,具有进化快、缺乏重组、母系遗传的特点[14],被广泛用作鱼类群体遗传与系统进化研究中的分子标记[15,16]。本研究收集了广西全州、环江和融水三地的禾花鲤,测定了其线粒体D-loop区和Cytb基因的部分序列,在此基础上分析了广西禾花鲤的群体遗传结构,旨在为禾花鲤种质资源保护和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源及DNA提取

禾花鲤样本采集自广西壮族自治区全州(QZ)、融水(RS)和环江(HJ)三地稻田养殖禾花鲤,样本数量分别为45、47和39尾。剪取鱼鳍组织贴在滤纸上干燥保存,用蛋白酶K消化/苯酚-氯仿抽法提取鱼鳍组织的总DNA。获得的DNA沉淀,用适量去离子水溶解,-20℃保存备用。

1.2 线粒体DNA分析

基于已知鲤线粒体DNA序列(GenBank登录号:X61010),设计L15239(5′-TTTAACCGAGACCA ATGACT-3′)和H16230(5′-CGTTGTTTAGAGGT GTGTAGTA-3′)引物对,L16500(5′-AGCGCCCA GAAAAGAGAGAT-3′)和H1091(5′-GGGCATA TTCACTGGGTTGCGGA-3′)引物对,分别扩增禾花鲤Cytb基因和D-loop区序列。PCR反应体系体积为50 μL,含有1× ExTaqmix(康为世纪),约50 ng DNA模板,正反向引物各20 pmol。PCR扩增程序如下:94℃预变性2min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环;最终72℃延伸10min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增的产物进行检测,确认目的条带有效扩增并切胶回收后,用ABI 3730XL平台测序。

1.3 数据处理与分析

测序结果用ClusterW软件[17]进行排序(alignment),并辅以人工检查校正。排序对齐后的序列截取相同长度,依据样品的个体来源将Cytb序列与D-loop序列串联,形成组合序列。用Arlequin 3.5软件[18]统计单倍型数(Number of haplotypes,H)、单倍型多样性(Haplotype diversity,Hd)、核苷酸多样性(Nucleotide diversity,π)、多态位点数目(Number of polymorphic sites,S)和平均核苷酸差异(Mean number of pairwise differences,K)等遗传参数。以Arlequin 3.5软件[18]进行变异分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)检测遗传变异来源,并计算群体间的分化系数Fst。利用MEGA7软件[19]计算群体内和群体间的遗传距离,并构建不同单倍型间的Neighbor-Joining系统发育树。

2 结果

2.1 禾花鲤线粒体DNA序列变异

本研究测定了禾花鲤Cytb基因中795 bp序列,序列中T、C、A和G四种碱基的平均比例分别为26.7%、30.4%、28.7%和14.2%。A+T的含量高于G+C的含量,碱基组成具有明显的偏倚性。在131条Cytb序列中,检测到15种Cytb单倍型,共有24个变异位点,占总位点数的3.02%,均为简约信息位点。

获得了131尾样本线粒体D-loop区5′端约698 bp的序列,序列中T、C、A、G四种碱基的平均比例分别为35.6%、17.1%、32.9%和14.3%。A+T的含量为68.5%,明显高于G+C的31.5%含量,碱基明显偏向A+T。在131条序列中,共获得了15种D-loop区单倍型,共有25个变异位点,占总位点数的3.58%,其中插入/缺失(indel)位点2个,单突变位点有1个,简约信息位点有22个。

将Cytb基因序列与D-loop区序列串联后,共检测到19种联合单倍型(表1)。单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)等遗传参数见表2,线粒体DNA的D-loop和Cytb基因的多样性水平相似,都表现出较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性。全州群体遗传多样性水平最高,融水群体次之,环江群体的遗传多样性则最低。

2.2 禾花鲤线粒体DNA遗传结构

基于串联序列的分子方差分析(AMOVA,表3)结果显示3个禾花鲤群体之间的变异占总遗传变异的28.46%,而群体内的遗传变异占71.54%。遗传分化指数Fst=0.285,并且差异显著(P＜0.01)。

群体间遗传分化(Fst)和群体内及群体间平均遗传距离结果见表4,群体间的Fst数值在0.112—0.379,环江、融水和全州三地禾花鲤均有明显的遗传分化,并且差异显著(P＜0.01)。相对而言,环江群体与另两个群体差异均较大,全州与融水群体的遗传分化较小,而全州与环江的遗传分化最大。

2.3 禾花鲤线粒体DNA单倍型系统发生

如前所述,禾花鲤的传统养殖区恰好是远东鲤(C. c. haematopterus)与华南鲤(C. c. rubrefusus)的重叠分布区[8—10]。Zhou等[20—22]曾经研究了的远东鲤、西鲤和华南鲤三个鲤亚种线粒体D-loop和Cytb基因的序列变异。为探明禾花鲤线粒体DNA的系统发生关系,我们将Zhou等[20—22]的数据一并纳入系统发育分析,并以鲫(Carassius auratus)的同源序列为外类群,利用邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建单倍型系统发育树(图1)。所有线粒体单倍型聚为三支,分别对应于西鲤(C. c. carpio)、远东鲤(C. c.haematopterus)和华南鲤(C. c. rubrefusus),其中远东鲤和华南鲤的关系较近。本研究检测到的禾花鲤19种单倍型中,分别有一种单倍型(hap1)属于西鲤类型,一种单倍型(hap14)属于远东鲤类型,其余17种单倍型均属于华南鲤类型。如表1所示,西鲤类型单倍型(hap1)在环江禾花鲤中高频出现,同时在融水群体中也有3尾个体是该单倍型(hap1),而全州和融水群体中均有低频的远东鲤类型单倍型(hap14)。

表1 禾花鲤线粒体Cyt b和D-loop部分序列单倍型的群体分布Tab.1 Variation sites and population distribution of mitochondrial haplotypes in rice flower carp

3 讨论

基于线粒体D-loop区和Cytb基因序列的禾花鲤遗传结构分析表明,禾花鲤总体上遗传多样性较丰富,表现为单倍型数较多,单倍型多样性较高。鲤在欧亚大陆有着广泛的地理分布,养殖历史悠久,形成了多个亚种和养殖品种,同时还被人为引入到世界各地[4,5,10],有丰富的遗传多样性是符合预期的。但是,本研究中三地禾花鲤的核苷酸多样性并不高。Thai等[23]研究发现鲤(Cyprinus carpio)线粒体DNA的核苷酸多样性水平较低,并推测可能是由于鲤这个物种在进化历史上曾经历过较严重的遗传瓶颈。

中国的鲤(Cyprinus carpio)可以分为三个亚种,即西鲤、远东鲤、华南鲤[8—10]。Zhou等[20—22]研究了鲤3个亚种的Cytb基因和D-loop序列变异,结果证实西鲤、远东鲤和华南鲤线粒体DNA分别聚为一支,华南鲤与远东鲤的亲缘关系较近。本研究中检测到的19种单倍型中有17种属于华南鲤类型,并且有多个单倍型为2—3个群体间共享。检测到的19种单倍型中分别只有1种属于西鲤或远东鲤类型。其中,西鲤类型单倍型只出现在环江群体中,而远东鲤类型单倍型则为全州和融水群体间共享单倍型。因此,我们认为禾花鲤(至少母系起源上)应属于华南鲤亚种。

表2 禾花鲤三群体遗传多样性参数Tab.2 Genetic diversity parameters of three stocks of rice flower carp

表3 基于线粒体Cyt b和D-loop联合单倍型的分子方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance(AMOVA)based on Cyt b and D-loop concatenated haplotypes

表4 基于线粒体Cyt b基因和D-loop区联合单倍型群体间的遗传分化系数Fst(对角线下方)、群体间的遗传距离(对角线上方)及群体内遗传距离(对角线上)Tab.4 Population pairwise Fst(below diagonal),genetic distances among populations(above diagonal)and genetic distances within populations(on diagonal)based on combined Cyt b gene and D-loop sequences

图1 禾花鲤线粒体DNA单倍型的NJ进化树Fig.1 NJ phylogenetic tree of mitochondrial DNA haplotypes in rice flower carp(Cyprinus carpio)

本研究中环江群体只检测到4种不同的单倍型,单倍型数较少,其中的优势单倍型(hap1)占到所有39尾样本的58.85%。并且该单倍型(hap1)还属于西鲤类型。如前所述,西鲤在中国自然分布区局限于新疆的部分水系,本研究的样本采集地并不是其分布区。但是,鲤是世界性的水产养殖种,中国曾引进欧洲和中亚起源的鲤养殖品种,如德国镜鲤和散鳞镜鲤,并广泛用作养殖品种或育种亲本[4,5,24]。因此,环江禾花鲤有可能渗入西鲤的遗传物质,可能在其繁育过程中与其他鲤品种有过杂交。虽然环江群体的单倍型多样性较低,但是其核苷酸多样性却是三个群体中最高的,这与其群体中存在明显的线粒体谱系混杂有关。融水群体中也有少量的西鲤单倍型(hap1)和远东鲤单倍型(hap14),提示融水禾花鲤也可能受到其他鲤养殖品种的遗传渐渗。全州群体的遗传多样性最丰富,共有11种不同单倍型,其单倍型多样性也是三个群体中最高的。全州群体的线粒体单倍型主要是华南鲤类型,但是也存在个别的远东鲤的单倍型(hap14)。全州是禾花鲤养殖历史最为悠久的地区,其禾花鲤遗传多样性较高可能与当地居民习惯自繁自养,不进行高强度选育有关,较好地保持了地方品种的特色。

本文研究结果表明,广西禾花鲤具有较高的遗传多样性,各地禾花鲤已经产生了明显的遗传分化,同时提示在禾花鲤繁育过程中可能存在利用不同来源鲤种质培育或生产禾花鲤的情况。本研究初步揭示了广西禾花鲤的种质资源现状,为禾花鲤这一地方特色“稻鱼共作”品种的选育和苗种管理提供了必要的依据。如前所述,鱼类线粒体DNA具有进化快、缺乏重组、母系遗传的特点,有利于初步揭示种质资源状况[14]。但是为弥补线粒体DNA母系遗传的不足,后续有必要利用微卫星等核基因标记研究禾花鲤群体遗传结构,以更加全面地评估禾花鲤受其他鲤种质遗传渐渗的风险。