虾青素对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞氧化应激的保护作用

李露壮，姜衍，徐爱华，辛昊，王京杨，孙永新

（中国医科大学 1.附属第一医院康复医学科；2.附属第一医院药学部，沈阳 110001；3.口腔医学专业102期，沈阳 110122）

骨髓间充质干细胞（bone marrow messenchymal stem cell，BMSC）是从骨髓中分离出的具有强大增殖和分化能力的多能干细胞［1］。近年来，BMSC广泛用于治疗骨骼肌肉疾病，包括骨与肌腱软骨再生和骨不连等。由于病变组织局部活性氧增加及清除失衡［2］而产生氧化应激微环境，导致细胞在移植后大量死亡，从而极大影响了疾病预后。因此，探索移植后BMSC抗氧化应激和抗凋亡的方法，是促进BMSC移植后存活的关键［3］。虾青素是一种安全无毒的脂溶性、橙红色类胡萝卜素，在生物体内发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种作用［4］。氧化应激可能通过核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化响应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路诱导细胞凋亡［5-6］。

本研究采用过氧化氢（H2O2）诱导BMSC建立氧化应激模型，通过检测细胞存活率、细胞凋亡率、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量及Nrf2/ARE通路相关蛋白表达量的改变，探讨虾青素对体外BMSC氧化应激模型的预保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人BMSC细胞株（中国科学院细胞库）。

1.1.2 试剂：虾青素标准品、CCK-8检测试剂、MDA检测试剂盒、SOD检测试剂盒、GSH检测试剂盒、30%H2O2溶液、ECL显影液（北京索莱宝公司）；二甲基亚砜（美国Sigma公司）；DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（中国Genview公司）；胎牛血清（中国四季青公司）；Nrf2抗体、血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）抗体、还原型辅酶/醌氧化还原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）抗体（美国ABclonal公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（中国诺唯赞公司）。

1.1.3 仪器与设备：CO2恒温培养箱、酶标仪（美国Therom公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；台式高速低温离心机（美国Sigma公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；显微镜（日本Nikon公司）；25 cm2培养瓶、6 cm培养皿、6孔板、96孔板（澳大利亚BEAVER公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：将人BMSC接种于25 cm2培养瓶，加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱培养。细胞生长到80%～90%融合时传代，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代，选取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞存活率实验：

1.2.2.1 建立H2O2诱导的BMSC氧化应激模型 将培养的BMSC以1×104/mL的密度接种于96孔板，每孔180 μL，在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养12 h后，分别用0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2溶液处理，每组设置3个复孔。处理24 h后CCK-8法检测细胞存活率，吸去旧培养液，每孔加入90 μL新鲜培养基，再加入10 μL CCK-8溶液，继续培养3 h。酶标仪检测450 nm处各孔的吸光值。

1.2.2.2 虾青素预保护BMSC的最佳浓度范围 将培养的BMSC接种于96孔板，分别用含0、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600、3 200 μmol/L的虾青素培养液处理，24 h后CCK-8法检测细胞存活率，方法同1.2.2.1。确定虾青素预保护最佳浓度范围。

1.2.2.3 虾青素对H2O2诱导的BMSC氧化应激的保护作用 将培养的BMSC接种于96孔板，分别用0、25、50、100、200 μmol/L的虾青素预保护2 h，之后用500 μmol/L H2O2诱导24 h，CCK-8法检测细胞存活率，方法同1.2.2.1。对照组（0 μmol/L）细胞存活率设为100%，细胞存活率（%）=（A加药组-A空白）/（A对照组-A空白）×100。

1.2.3 氧化应激相关酶活性检测：BMSC接种于6孔板，密度为1×105/mL，细胞培养至贴壁后，分为对照组、虾青素组、H2O2组、虾青素+H2O2组。虾青素组使用200 μmol/L虾青素溶液处理BMSC 2 h，H2O2组使用500 μmol/L H2O2溶液诱导BMSC 24 h，虾青素+H2O2组使用200 μmol/L虾青素预保护BMSC 2 h后再使用500 μmol/L H2O2诱导24 h。细胞消化后1 000 r/min低速离心，收集细胞沉淀，加入提取液，超声震碎细胞，8 000g、4 ℃离心10 min。根据试剂盒说明书，分别检测细胞SOD活性和GSH含量。细胞消化后，收集细胞沉淀，加入3倍沉淀体积的提取液重悬细胞，反复冻融2～3次，8 000g、4 ℃离心10 min，收集上清，根据试剂盒说明书检测MDA含量。独立实验重复3次。

1.2.4 细胞凋亡率检测：BMSC接种于6 cm培养皿，细胞分组同1.2.3。收集细胞，用预冷PBS冲洗2次，1 mL结合缓冲液重悬细胞，300g离心10 min，弃上清，用1 mL结合缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到1×106/mL。取流式测定管，每管加100 μL细胞溶液，再加入5 μL Annexin V-FITC，避光室温染色10 min，再加入5 μL碘化丙啶，避光室温孵育5 min，加PBS至500 μL，1 h内在流式细胞仪上检测，应用Flowjo10软件分析。独立实验重复3次。

1.2.5 Western blotting：细胞接种于6 cm培养皿，细胞分组同1.2.3。用预冷的PBS清洗3次，冰上加蛋白裂解液RIPA，用清洁的细胞刮收集细胞，4 ℃、12 000g离心15 min，收集上清，置于冰上待用。BCA试剂盒测定蛋白浓度。调节蛋白浓度，制备10%分离胶、5%浓缩胶，SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白封闭1 h。TBST摇床洗膜3次后，一抗孵育。一抗为兔源Nrf2抗体（1∶2 000稀释）、兔源HO-1抗体（1∶1 500稀释）、兔源NQO1抗体（1∶1 500稀释），4 ℃过夜。TBST摇床洗膜3次后，加入二抗室温孵育1 h，二抗为羊抗兔IgG（1∶5 000稀释）。电化学发光显影，应用Image J软件分析灰度值。

1.3 统计学分析

所有实验均重复3次。应用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虾青素预保护对H2O2诱导的BMSC存活率的影响

2.1.1 H2O2诱导BMSC建立氧化应激模型：BMSC经H2O2诱导后，细胞存活率明显下降，呈浓度依赖性，H2O2浓度越大，细胞存活率越低（图1A），且存活率随H2O2诱导时间延长而下降（图1B）。500 μmol/L H2O2诱导24 h时，细胞存活率约为对照组的50%～60%（P＜ 0.05）。因此，后续实验选择500 μmol/L H2O2诱导24 h建立H2O2诱导氧化应激模型。

图1 建立H2O2诱导的BMSC氧化应激模型Fig.1 Model of H2O2-induced oxidative stress in BMSCs

2.1.2 虾青素预保护细胞最适浓度范围：用0～3 200 μmol/L的虾青素溶液处理BMSC 24 h，采用CCK-8法检测细胞存活率。结果表明，25～200 μmol/L的虾青素浓度为安全处理范围，与对照组相比，BMSC存活率的差异有统计学意义（P＜ 0.05）。确定虾青素预保护最适浓度范围为25～200 μmol/L。见图2。

2.1.3 虾青素预保护提高H2O2诱导的BMSC存活率：选取最适浓度范围（25、50、100、200 μmol/L）的虾青素预保护2 h，之后用500 μmol/L的H2O2诱导24 h。结果显示，不同浓度的虾青素预保护组与H2O2组比较，BMSC的存活率均明显升高（P＜ 0.05）；200 μmol/L虾青素预保护组与H2O2组比较，BMSC的存活率明显升高（P＜ 0.05）。显微镜下观察细胞形态，也证实200 μmol/L虾青素预保护组BMSC存活率最高，因此后续试验选择200 μmol/L浓度作为预保护浓度。见图3。

图2 不同浓度虾青素对BMSC存活率的影响Fig.2 Viability of BMSCs treated with varying concentrations of astaxanthin

2.2 氧化应激相关酶活性的检测

图3 虾青素预保护对H2O2诱导的BMSC存活率的影响Fig.3 Effect of astaxanthin pretreatment on the viability of BMSCs subjected to H2O2-induced oxidative stress

结果显示，H2O2组的SOD活性和GSH含量较对照组下降（P＜ 0.05），MDA含量较对照组明显升高（P＜0.05）；虾青素+H2O2组SOD活性和GSH含量较H2O2组明显升高（P＜ 0.05），MDA含量较H2O2组明显下降（P＜ 0.05）。见图4。

2.3 虾青素对H2O2诱导的BMSC凋亡的影响

图4 虾青素对H2O2诱导的BMSC中SOD、GSH、MDA的影响Fig.4 Effect of astaxanthin on SOD，GSH，and MDA levels in BMSCs subjected to H2O2-induced oxidative stress

为探究虾青素预保护对H2O2诱导的BMSC凋亡是否有保护作用，使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒和流式细胞仪进行检测。结果显示，H2O2组（59.6%）与对照组（2.7%）比较，细胞凋亡率升高（P＜0.05）；虾青素+H2O2组（17.3%）与H2O2组（59.6%）比较，细胞凋亡率明显下降（P＜ 0.05）。见图5。

图5 虾青素对H2O2诱导的BMSC凋亡的影响Fig.5 Effect of astaxanthin on apoptosis in BMSCs subjected to H2O2-induced oxidative stress

2.4 虾青素通过Nrf2/ARE信号通路对H2O2诱导的BMSC发挥保护作用

采用Western blotting检测Nrf2、HO-1、NQO1蛋 白表达水平。结果显示，与对照组相比，H2O2组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达均明显降低（P＜ 0.05）；虾青素+H2O2组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达较H2O2组均明显升高（P＜ 0.05）。说明虾青素预保护能够促进Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表达，其保护机制可能是激活了Nrf2/ARE信号通路。见图6。

图6 虾青素通过激活Nrf2/ARE信号通路保护H2O2诱导的BMSC氧化应激损伤Fig.6 Astaxanthin protects BMSCs from H2O2-induced oxidative stress via the Nrf2/ARE signaling pathway

3 讨论

BMSC具有较强的再生和分化能力，在组织修复和再生中具有重要作用［7］。然而，移植后细胞存在于氧化应激微环境会导致其死亡，这一直是研究面临的问题［8］。目前研究表明，辅酶Q可在体外保护BMSC氧化应激导致的凋亡，降低脊髓损伤大鼠的氧化应激环境［9］；青蒿素通过激活c-Raf-Erk1/2-p90rsk-CREB通路对大鼠BMSC氧化应激凋亡有保护作用［10］；石斛酚通过PI3K/Akt通路降低H2O2诱导的BMSC氧化损伤［11］。

虾青素最主要的生物学作用是抗氧化作用，其通过独特的分子结构，清除自由基和淬灭单线态氧［12］，在各组织器官中均发挥抗氧化作用［13］，具有极大的医学潜力。氧化应激是由于氧化剂MDA和抗氧化剂SOD-GSH之间不平衡导致［9］。本研究中，虾青素预保护组较H2O2组SOD活性和GSH含量明显提高，MDA含量下降，表明虾青素具有抗氧化应激的能力。细胞凋亡检测结果显示，虾青素预保护组较H2O2组细胞凋亡率明显下降。

Nrf2/ARE信号通路被认为是细胞抗氧化应激的主要信号通路。Nrf2是一种在多种细胞中表达的碱性亮氨酸拉链转录因子［14］，参与调节多种抗氧化酶表达。正常生理状态下，细胞质中的Nrf2与keap1结合，呈无活性状态；当受到活性氧等刺激时，Nrf2与keap1脱离，转移至细胞核而激活，与ARE结合，激活HO-1、NQO1等抗氧化酶的转录和表达，从而抵抗外界刺激［15］。本研究采用虾青素预保护H2O2诱导的BMSC，结果表明，虾青素能够提高细胞内SOD活性和GSH含量、降低MDA含量、降低细胞凋亡水平、提高细胞存活率。进一步研究结果显示，虾青素组的Nrf2通路被激活，Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达较H2O2组显著升高。因此，虾青素的保护机制可能通过激活Nrf2/ARE信号通路实现。

综上所述，虾青素通过Nrf2/ARE信号通路对氧化应激环境下的BMSC起抗凋亡和抗氧化作用。可用于干细胞移植疗法中提高BMSC存活率，提高干细胞移植治疗效率，为干细胞治疗骨再生提供了新思路。