近红外高光谱成像技术在筛查保健食品中违禁添加抗炎药物双氯芬酸钠的研究

王 成，于 航，姚卫蓉，成玉梁，郭亚辉，钱 和，谭志强，谢云飞*

1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122 2.中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085

引 言

双氯芬酸钠(Diclofenac sodium)是一种非甾体抗炎药，常被用于疼痛、风湿性关节炎和某些非风湿性疾病，其对哺乳动物有多重负面影响，包括心毒性、肝毒性、肾毒性、神经毒性、基因毒性和血液毒性[1]。

目前，非甾体抗炎药在兽药中被广泛使用。可以用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定牛奶[2]、猪肉和鸡蛋中的双氯芬酸钠[3]。从废水、尿液、牛乳和血浆中使用电膜萃取作为酸性化合物的双氯芬酸钠，并采用高效液相色谱法进行定量分析[4]。同时，双氯芬酸钠在水体中降解性差，在污水处理中不易被处理，对水生生物如鱼类、贻贝等具有潜在毒性[5]。以AgMBA@SiO2-Ab为免疫探针，采用基于表面增强拉曼散射(SERS)的免疫层析法可以快速、定量、超敏检测水样中的双氯芬酸[6]。这些实验方法都要做较多前处理实，比较耗时。近红外光谱结合人工神经网络无损定量分析双氯芬酸钠粉体[7]的方法在一次检测中也需要大量的实验样品。

虽然近红外是一种有效的无损检测手段，但是不能提供被测物质的空间信息及化学信息的变化。相较之下，近红外高光谱成像(near-infrared hyper spectral imaging，NIR-HSI)将计算机成像系统和传统的近红外技术结合，可以同时采集待测物的空间信息和化学信息。近红外高光谱成像技术在食品检测领域已有研究，在近红外区间(990～1 700 nm)建立并评价自特征提取的深度学习模型用于无损检测掺假红肉产品[8]或鉴别转基因大豆。利用NIR-HIS在990～1 700 nm结合光谱相似性测量方法[9]、偏最小二乘法[10]、波段比[11]方法分析了奶粉中非法添加三聚氰胺。NIR-HSI用于研究了无损定量检测花生籽粒中的油和蛋白质含量以及鸭梨中检测可溶性固形物含量[12]。尝试近红外高光谱成像技术与紫外分光光度法结合来估计大麦麦芽中酚类化合物的浓度[13]。

本文主要是探索利用近红外高光谱成像(1 000～2 500 nm)无损、快速检测缓解炎症保健食品中违禁添加的化学物质的方法，阐述近红外高光谱成像技术在快速定量检测保健食品中违禁添加抗炎药物双氯芬酸钠的可能性。

1 实验部分

1.1 样品

实验用缓解炎症保健食品从Perth WA Australia代购，没有任何化学预处理。双氯芬酸钠标准品(99%从上海Macklin)购买。保健食品和双氯芬酸钠混合物作为训练集的样本浓度(W/W)分别为0.01%，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.20%，0.40%，0.80%，1.00%，2.00%，4.00%，6.00%，8.00%，10.00%，12.00%，14.00%，16.00%，18.00%和20.00%，每个浓度样品各3组(编号1—20)，共60个样本。测试集的混合物浓度(W/W)为0.05%，0.50%，1.50%，5.00%，11.00%，15.00%每个样品浓度各3组(编号CK1—6)，共18个样本。保健食品粉碎后，样品浓度(W/W)低于0.02%的混合物称取10 g，其他浓度样品混合物各称取6.7 g，称好放入50 mL离心管中在振荡器上混合均匀。将混合样品取出装满塑料培养皿(直径30 mm×厚度10 mm)中，轻轻振荡使得样品表面平整。同一样品重复两次测量光谱数据。

1.2 高光谱成像系统

采用GaiaSorter-N25E室内近红外高光谱成像系统(四川双利合谱科技有限公司)，高光谱设备主要由四个部分组成，包括短波红外高光谱相机、光源、样品置物台和计算机。其中光源是由2套50W卤素灯光源组成，两组光源被安置在平台两侧，光源高度为25 cm，安装角度为30°。短波红外高光谱相机包括芬兰Specim公司的Imspector系列成像光谱仪和MCT探测器，波段范围为982～2 591 nm，光谱分辨率为12 nm(288个波长)。高光谱相机的曝光时间设置为8 ms，样品放置在电机移动平台上，移动范围9～27 cm，在成像系统视场范围内对样品逐行扫描，步进电机由相连的计算机控制，扫描前进的电机速率为0.8 cm·s-1。利用光谱图像软件实现了系统控制和数据采集。

此外，为了获得较稳定和有可比性的模型数据，还需要使用两个额外的图像:一个暗电流图像(D)和一个白色参考图像(W)来校正原始获得的图像(R0)[14]。反射率大约为0%的暗电流图像(D)是通过用不透明的遮光罩完全覆盖摄像机镜头获得的，而漫反射系数为～99.9%的白色参考图像(W)，校正公示为

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所有的暗板，白板都由系统自带，通过高光谱软件获得校正光谱数据。

1.3 高光谱数据分析

对采集的高光谱图像由ENVI4.8软件(ITT Visual Information Solutions,Boulder,CO,USA)提取和计算感兴趣区域的平均光谱数据，选择1 000～2 524 nm波段及特征波段的光谱作为定量分析的输入变量。

光谱数据包含的信息比较丰富，大量的信息会包含各种各样的随机噪声，相机暗电流等，会对数据分析产生较大影响[15]。在建立模型前对光谱数据进行预处理是有必要的，可以减少噪声及外界的影响。主要的预处理方式有移动平均法(moving average，MA)，高斯滤波(Gaussian filter，GF)，中值滤波(median filter，MF)，归一化(normalize)，卷积平滑(savitzky-golay smoothing，SG-Smoothing),标准正态变量(standard normal variate，SNV)，基线处理(baseline)，多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)。数据的预处理和分析都使用The Unscrambler X10.4(CAMO Software AS,Norway)。

使用三种线性回归的模型，包括偏最小二乘回归(partial least squares regression，PLSR)，主成分回归分析(principal component regression，PCR)及多元线性回归(multiple linear regression，MLR)模型。

(1) PLSR模型

建立PLSR模型，将样本的光谱与违禁添加物的浓度联系起来。当被测变量众多且高度共线(相关)时，PLSR成为构建模型的最稳健、最可靠的化学计量方法。通过PLSR找出自变量(X)与因变量(C)之间的基本关系，从而将原来的预测因子简化为主成分因子(LVs)的新变量集，该变量矩阵具有最佳的预测能力[16]。这些LVs在统计上是独立的，即不相关，为了防止模型出现过拟合或欠拟合，要选择最优的Lvs的数量[17]，在本文使用内部交叉验证(cross-validation，CV)过程中使用均方根(root-mean-square,RMS)的最小值来选择LVs的最优数量。PLSR中自变量(X)与因变量(C)的基本关系可以用式(2)来表示

C=B1X1+B2X2+…+BnXn+B0

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式(2)中，C为双氯芬酸钠的浓度，B1—Bn是272个波长对应的回归系数，X1—Xn为每个浓度样本的光谱，B0是回归系数的截距。

(2) PCR模型

PCR分成两步，首先对光谱矩阵进行主成分分析，得到少数原始光谱矩阵的线性组合变量，并将数据的最大方差投影到新的坐标，选取出重要的主成分数，进行多元线性回归。

(3) MLR模型

多元线性回归模型用于确定多个自变量的组合来共同估计因变量，本研究需要选择好特征光谱波长或区间建立模型预测保健食品中混合的双氯芬酸钠的含量，MLR的公式如式(2)。

1.4 选择特征波段

高光谱图像中的信息量丰富，存在高维的、多共线性的预测准确性降低的问题。因此，找出特征波段，利用有效的特征波段信息与双氯芬酸钠的含量建立关系，提高模型准确性很有必要。采用基于PLSR模型加权回归系数从全光谱范围中选择特征波长[12]。加权回归系数的方法,也称为β系数方法，用产生的绝对值大的回归系数作为最佳波段并建立MLR模型。

1.5 模型评价

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(4)

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式中，n是样品数，Ycal是样品的训练值，Ypi是样品的预测值，Yti是样品参考真实值，Ym是样品参考的平均值。

2 结果与讨论

2.1 双氯芬酸钠的近红外高光谱分析

提取双氯芬酸钠(Diclofenac)、缓解炎症保健食品(KB)、缓解炎症保健食品中不同含量的双氯芬酸钠混合物(编号1—20)的平均原始谱图(提取面积为直径30 mm培养皿样品表面的ROI)，如图1所示。从图1可以看出双氯芬酸钠的吸收峰与缓解炎症保健食品的吸收峰位置有明显区别，即平均光谱图中双氯芬酸钠的吸收峰在1 141，1 507和1 675 nm为XH(C，N，O)第一泛音、伸缩振动及XH(C，N，O)合频，2 161和2 407 nm为组合频吸收[18]。缓解炎症保健食品与缓解炎症保健食品中掺有不同含量的双氯芬酸钠混合物的平均原始光谱无法区分。

图1 双氯芬酸钠(Diclofenac)、缓解炎症保健食品(KB)、缓解炎症保健食品中不同含量的双氯芬酸钠混合物(编号1—20)的平均原始谱图Fig.1 Mean original spectra of Diclofenac Sodium，Anti-inflammatory dietary supplements (KB),different concentrations of diclofenac sodium compounds (No.1—20) in inflammation-reducing dietary supplements

图2中是三组双氯芬酸钠(Diclofenac)、缓解炎症保健食品(KB)及缓解炎症保健食品中掺有不同含量的双氯芬酸钠混合物(编号1—20)的平行样品在双氯芬酸钠的特征波长1 675 nm处的成像图。双氯芬酸钠和缓解炎症保健食品的图像有一定程度的差异，但两者混合物的成像图无法肉眼识别其中双氯芬酸钠的含量，需要进一步的方法进行区分。

图2 1 675 nm处缓解炎症保健食品(KB)、双氯芬酸钠(Diclofenac sodium)及缓解炎症保健食品中0.01%～20%含量的双氯芬酸钠高光谱成像图Fig.2 Hyperspectral images of 0.01%～20% Diclofenac sodium in anti-inflammatory dietary supplements (KB), anti-inflammatory dietary supplements and Diclofenac sodium (Diclofenac) at 1 675 nm

2.2 不同建模方法的比较分析

编号1—20的120个样品中随机选择104个样品光谱作为训练集并使用内部交叉验证，编号CK的36个样品中随机选择30个样品光谱作为测试集。为了比较不同建模方法对实验结果的影响，主要使用上述8种处理光谱数据并建立了PLSR，PCR和MLR三种模型，获得了校正集、验证集、测试集模型的R2，RMSE等相关参数。

2.2.1 PLSR模型

表1 基于全光谱波长的PLSR模型Table 1 PLSR model based on full spectral wavelength

2.2.2 PCR模型

表2 基于全波长的PCR模型Table 2 PCR model based on full spectral wavelength

2.2.3 MLR模型

表3 基于最佳波段建立MLR模型Table 3 MLR model based on optimal spectral band

图3 偏最小二乘回归(PLSR)模型中β回归系数权值占比选择较优波段Fig.3 Selection of the optimal spectral bands by weight ratio of β regression coefficients in the partial least squares regression (PLSR) model

2.3 预测结果的验证

表4显示了PLSR，MLR和PCR三种模型平均预测值与真实值，其中MLR模型预测的双氯芬酸钠含量较低(0.05%)时，平均预测值比真实值偏高，但两者相差较小，双氯芬酸钠含量较高时预测结果更接近真实值。PLSR，PCR模型预测双氯芬酸钠含量低于0.5%时的预测值与真实值相差较大。在高浓度时，后两个模型预测能力相对MLR模型稍差。所以，MLR模型预测不同浓度的双氯芬酸钠的准确性和重复性较好，预测能力较强。

表4 PLSR，PCR，MLR模型预测值与真实值比较Table 4 The predictive values of PLSR,PCR and MLR models compared with real value

3 结 论

探讨了近红外高光谱成像技术在缓解炎症保健食品中添加不同含量抗炎类药物双氯芬酸钠的无损检测分析。使用了8种不同的光谱预处理方法，建立了全光谱PLSR和PCR模型，利用β系数方法选择最优波段1 130～1 147，1 412～1 468，1 658～1 709，2 010～2 055，2 122～2 178和2 395～2 423 nm，经SNV预处理方法建立的MLR模型，预测最低限为0.05%，预测值与实测值的R2为0.992 5，RMSECP为0.004 9，SEP为0.004 9。综上所述，说明近红外高光谱成像技术可用于快速、定量检测分析缓解炎症保健食品中违禁添加的双氯芬酸钠，有巨大应用潜力。