超高效液相色谱-二极管阵列检测法测定油基类保健食品中的维生素K2的含量

沈珊珊 赵志红 吴 琴 李 瑞 余家胜 杨佳雯

(杭州娃哈哈集团有限公司，杭州 310018)

天然维生素K是一类具有2-甲基-1，4-萘醌母体结构的脂溶性维生素，参与人体骨代谢和细胞生长，具有促进凝血、抗骨质疏松等重要生理功能[1-3]。根据化学结构不同，天然维生素K分为维生素K1(vitamin K1, VK1)和维生素K2(vitamin K2, VK2)两类[4]。其中VK2又称甲萘醌，是唯一具有生物活性的维生素K，VK1须在肝脏内转化为VK2才能被人体吸收利用。VK2为系列化合物，根据母环C-3位上取代基异戊二烯单位个数不同分为14种，以MK-n表示，n即为异戊二烯单元数量(如图1所示)。其中以七烯甲萘醌(menatetrenone7, MK-7)的生物活性和生物利用度最优[5,6]。近年来相关临床研究发现，VK2具有不同于VK1重要的生物活性和药用价值[7]，如防止并逆转心血管钙化，预防肝硬化，预防老年痴呆，降低II型糖尿病风险，抗风湿性关节炎，预防静脉曲张，促进人体皮肤健康， 治疗原发性痛经等[8,9]。

维生素K2主要由微生物代谢产生，在天然食物中含量较少。随着其药用价值的逐步凸显，VK2已然成为国际上保健品添加剂的新一代宠儿。1995年，日本首次将VK2作为治疗骨质疏松药物应用于临床治疗[10]。2008年11月14日是VK2发展的一个里程碑。欧洲食品安全局(EFSA)公布了有关从纳豆提取的VK2(MK-7)作为膳食补充剂和食品添加剂的科学意见[11]。2009年，欧盟通过了2009/345/EC决议，批准VK2可作为新型食品配料投放市场[12]。美国药典委员会发布的《2015年膳食补充剂刚要》也发表支持VK2开发的准入标准和准入评价结论[13]。2016年，我国卫计委发布的《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告(2016年第8号)》将VK2(MK-7)列入了食品营养强化剂新品种[14]。VK2作为功能因子的保健产品相关研发和生产正蓬勃发展，方兴未艾。

国家卫生计生委《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告(2016年第8号)》附件3中，有针对调制乳粉中食品营养强化剂的VK2(MK-7)的检测方法。该方法采用异丙醇直接萃取、高效液相色谱定性-定量。操作简单，检测快速，但只适用于营养强化剂等基质简单的样品。另外，保健食品中VK2的检测方法文献报道较少，主要包括液相色谱-紫外检测法[15]、液相色谱-荧光检测法[16]、液相色谱-串联质谱联用法[17]等，所采用的前处理方法与卫健委2016年第8号公告中方法基本一致，采用异丙醇等良溶剂直接萃取法。市场上各类保健食品品类繁多、基质复杂，尤其是脂质本底高的样品，直接萃取法往往萃取不完全且杂质干扰严重。另一方面，保健食品中维生素K2添加量一般较高，紫外或二极管阵列检测器即可满足灵敏度要求。

现行的国际标准中，VK1的检测方法已较为详尽，例如EN 14148-2003[18]、AOAC Official Method 999.15[19]等，但VK2的相关方法仍是空白，亟待开发。本实验针对油基类保健食品，采用酶解法-萃取法去除基底中大量的脂肪。采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器对样品进行分析检测，减少了有机试剂的使用，更为环境友好，并利用保留时间和光谱图定性，提升检测的准确性。本方法高效、准确、快速、灵敏，为保健食品中VK2的检测、质控和监管提供了技术支撑，维生素K2化学结构式见图1。

图1 维生素K2化学结构式

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

某品牌维生素K2保健食品(软胶囊、颗粒剂)，市售；维生素K2(MK-7)标准溶液 ，100 mg/L，美国Sigma-Aldrich公司 ，CAS：2124-57-4；脂肪酶(酶活力≥30 U/mg)，美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇，分析纯；碳酸钾，分析纯；正己烷，分析纯；氢氧化钾，分析纯；磷酸二氢钾，分析纯；异丙醇、甲醇，色谱纯。

Acquity UPLCTM液相色谱仪 ，配二极管阵列(PDA)检测器 ，美国Waters公司；XS205DU电子分析天平，Mettler Toledo国际有限公司；多管涡旋振荡器 ，杭州奥盛仪器有限公司；pH计 ， Mettler Toledo国际有限公司；离心机，Eppendorf国际贸易有限公司；恒温水浴振荡器，北京五洲东方公司；氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；Waters BEH-C18 色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，美国Waters公司。

1.2 方法

色谱柱：Waters BEH-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇，等度洗脱；流速：0.3 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：2.5 μL。

1.3 溶液配制

1.3.1试剂配制

40% 氢氧化钾溶液：称取 20g 氢氧化钾于100 mL 烧杯中，用20 mL水溶解，冷却后，加水至50 mL，储存于聚乙烯瓶中。

磷酸盐缓冲液(pH 7.5)：溶解54.0g磷酸二氢钾于300 mL水中，用40%氢氧化钾溶液调节pH至7.5，加水至500 mL。

1.3.2标准工作溶液

分别准确吸取维生素K2(MK-7)标准溶液0.100 mL、0.200 mL、0.500 mL、1.00 mL、2.00mL于10 mL棕色容量瓶中，加异丙醇定容至刻度，维生素K2标准系列工作溶液浓度分别为1.00 mg/L、2.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L。

1.3.3样品溶液

取10粒胶囊内容物，尽量挤尽，混匀后直接取样。样品避光保存，制样后尽快测定。准确称取混匀的试样1 g(精确到0.001 g)于50 mL离心管中，加入磷酸盐缓冲液(pH 7.5) 5 mL,混匀，加入0.3 g脂肪酶，加盖，涡旋 2 min～3 min，混匀后,置于35±2 ℃恒温水浴振荡器中振荡2 h以上，使其充分酶解。取出酶解好的试样，分别加入10 mL乙醇及1 g碳酸钾，混匀后加入10 mL正己烷和10 mL水，涡旋提取10 min，6000 r/min离心5 min，静置分层，转移上清液至100 mL旋蒸瓶中，向下层液再加入10 mL正己烷。重复操作1次，合并上清液。将上述正己烷提取液N2吹或旋蒸至干，用异丙醇转移并定容至10 mL，摇匀，0.2 μm滤膜过滤，即得样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 维生素K2稳定性分析

本实验对光照、温度、pH等因素对VK2稳定性的影响进行了系统性的研究，以为建立其科学、准确的分析方法提供科学依据。

2.1.1温度

将VK2标准溶液分别置于室温、60℃条件下放置0、5、10、30、60、120、240min后进行液相色谱检测，以各时间与0min时VK2峰面积比(Ai/A0)为纵坐标，以放置时间(min)为横坐标，实验结果如图2所示。在室温下(图2(A))，VK2相对峰面积基本保持一致，说明室温条件下VK2稳定。在60℃条件下(图2(B))，VK2相对峰面积略有升高，推测是因为在该温度下，溶液溶剂挥发导致。上述实验结果说明，适当的高温不影响VK2的稳定性。

图2 不同温度条件下维生素K2的稳定性(A).室温；(B)60 ℃

2.1.2光照

将VK2标准溶液分别置于普通灯光、阳光照射条件下放置0、5、10、30、60、120、240min后进行液相色谱检测，以各时间与0min时维生素K2峰面积比(Ai/A0)为纵坐标，以放置时间(min)为横坐标，实验结果如图3所示。在普通灯光下(图3(A))，VK2相对峰面积基本保持一致，说明普通灯光光源对VK2稳定性无影响。而在阳光直射下(图3(B))，VK2急剧降低，约5min时即下降至原含量的50%，60min后几乎完全降解。类似地，当将VK2至于紫外光辐射下也得到了相似的实验结果。上述实验现象说明，VK2对阳光和紫外光极为敏感。

图3 不同光照射下维生素K2的稳定性(A).普通灯光；(B).日光

2.1.3pH

将VK2标准溶液分别置于0.1M HCl (pH 1)、pH 7.5PBS缓冲液、0.1M NaOH (pH 13)的下放置0、10、30、60、120、240min后进行液相色谱检测，以各时间与0min时VK2峰面积比(Ai/A0)为纵坐标，以放置时间(min)为横坐标，实验结果如图4所示。实验时间范围内，在酸性和弱碱性(pH 7.5)条件下，VK2相对峰面积基本保持一致，说明酸、弱碱对VK2稳定性无明显影响。而在强碱性条件下，VK2随时间有所降解。上述实验现象说明，VK2在强碱条件下不稳定。

图4 在不同pH条件下维生素K2的稳定性

以上稳定性实验结果表明，强碱性条件、紫外辐射会导致VK2明显降解，而酸性条件、温度并未对VK2的稳定性造成显著影响。鉴此，在试样预处理过程中，须避免阳光直射、强碱试剂的使用。

2.2 酶解条件优化

VK2是脂溶性维生素，共存的脂质对其提取、检测均会造成不良影响。因VK2在强碱性条件下不稳定，无法采用皂化方法去除脂肪基质。本文采用脂肪酶酶解的方法降解基底中脂肪。由文献[20]可知米根霉产脂肪酶最适pH为7.5，最适温度为35℃，前期稳定性研究表明，在该pH和温度范围内VK2稳定。因此，本实验选用pH 7.5和35℃为酶解条件。

酶的用量及酶解时间对VK2的提取有一定影响。本实验以油基类软胶囊保健品为研究模型，采用空白基质加标方法，考察了不同酶用量(0.1 g、0.3 g、0.6 g)和酶解时间(10 min、30 min、60min、120 min、240 min)下样品的分析结果(见表1)。结果表明，在相同酶解时间下(120 min)，样品在酶用量为0.3 g时可酶解完全。考虑经济效益，本文选取0.3 g酶用量。在相同酶用量条件下(酶用量0.3 g)，酶解时间小于60 min结果偏低，分析是酶解不完全所致。酶解120 min、240 min，VK2回收率趋于稳定，考虑效率问题，本实验选取酶解时间为120 min。

表1 酶解条件的优化

2.3 液相色谱条件

参考国家卫生计生委2016年第8号公告中关于VK2液相色谱检测方法并作了些许改动： C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇，等度洗脱；流速：0.3 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：2.5 μL。

2.4 标准曲线及检出限、定量限

取1.3.2标准工作溶液，按1.2方法上机测定，记录峰面积。以维生素K2质量浓度作为横坐标(x)，峰面积作为纵坐标(y)制作标准曲线方程。本法在1.00 mg/L、2.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L范围内有良好的线性关系，标准曲线方程y=8.28×103x-1.37×103，R2=0.9999。以处理后的空白基质溶液逐步稀释标准品上机测定，检出限和定量限分别以3倍和10倍信噪比(峰高)计。结果表明，当取样量为1 g，定容至10 mL时，方法检出限为1 μg/g，定量限为3μg/g。

2.5 方法重复性

选择油基类保健品VK2软胶囊作为典型性样本，按1.3.3方法平行制备7份样品溶液，按1.2方法上机测定，记录峰面积，根据峰面积计算维生素K2含量及重复性相对标准偏差(RSD)，结果见表2。结果显示，7次平行实验RSD为1.2%，表明该法具有良好重复性。

表2 方法重复性

2.6 方法准确性

选择油基类空白基质样本作为研究模型，选取标准曲线低、中、高3水平添加维生素K2标准溶液，每水平3次平行，按1.3.3方法制备样品溶液，按1.2方法上机测定，记录峰面积，根据峰面积计算维生素K2含量及加标回收率，以加标回收率来考察本法的准确性，结果见表3。从表可得，利用此方法测定的加标样品数据结果均落在加标值附近，回收率范围98.7～102.2%，RSD为0.6～1.4%，准确性较好。

表3 方法准确性

2.7 试样溶液稳定性

取2.5方法重复性上机试液，于4℃避光保存24 h，按1.2方法上机测定，记录峰面积，根据峰面积计算24 h前后维生素K2含量，以考察试样溶液中VK2的稳定性(见表4)。由表可知，3次平行实验VK224 h前后含量的RE值均小于2.6%，说明在试验时间范围内VK2稳定性良好。

表4 样品上机液稳定性

2.8 方法比较

以软胶囊为分析对象，将本方法与卫计委《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告(2016年第8号)》附件3中维生素K2的检验方法进行比较，结果如图5所示。图5(A)为10 mg/LVK2标准溶液液相色谱图和PDA光谱图，图5(B)和图5(C)分别为采用公告方法和本法的液相色谱结果和PDA光谱图。通过比较可明显观察到，公告法采用异丙醇直接萃取VK2，提取不完全且脂质类基质干扰严重，导致PDA光谱图畸变(图5(B-2))，色谱图基线高且漂移(图5(B-1))，无法准确定量。而本法通过酶解去除了大量脂肪，PDA光谱图(图5(C-2))与标准溶液(图5(A-2))匹配性好，液相色谱图基线平稳(图5(C-1))，定量准确性大大优于前者。

图5 维生素K2标准溶液液相色谱图及相应光谱图(A).卫计委2016年第8号公告方法；(B).本法；(C).分析结果

2.9 方法应用

将本方法应用于另一款增加骨密度保健食品(颗粒剂)中VK2的检测。该保健食品中除VD3、VK2、硫酸软骨素等功效成分外，还添加了大量的可可粉、全脂乳粉等原料进行调味，脂质类基质含量高，常规异丙醇直接萃取方法无法有效分离分析其中VK2含量。采用本方法分析结果如表5所示。方法RSD为2.3%，回收率介于93.2%～95.6%，结果满意。

表5 方法应用

3 结论

建立了超高效液相色谱-二极管阵列检测法检测油基类保健品中维生素K2的分析方法，并对维生素K2的稳定性及酶解条件进行了研究。该方法线性范围内线性关系良好，相关系数R2=0.9999。当取样量为1 g，定容至10 mL时，方法检出限、定量限分别为1 μg/g、3 μg/g。7次平行实验RSD=1.2%。低、中、高3水平加标回收率介于98.7～102.2%，准确度良好。采用该方法可以准确、快速检测油状液体、固体类保健食品中维生素K2的含量。