阿司匹林联合长春瑞滨对人乳腺癌细胞MCF-7的作用机制研究

边 静，张彭辉，李佳佳(河南科技大学第一附属医院第二药房，洛阳 471300)

长春瑞滨(VNR)是一种新型的半合成长春碱类抗癌药[1]，主要作用于肿瘤细胞G2期，属细胞周期特异性药物[2]，可阻滞微管蛋白聚合并促进诱导微管的解聚，使肿瘤细胞在有丝分裂中受阻，导致分裂增殖停止于有丝分裂中期。研究表明，使用其他药物联合VNR治疗乳腺癌效果较好[3]。张旭等[4]研究表明，环氧合酶-2 (COX-2)在结肠癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤中呈现高表达，说明COX-2参与了多种癌症的发生与发展。吕田等[5]研究表明，非甾体抗炎药物可通过抑制 COX-2 发挥抗炎、镇痛等作用，本文旨在研究阿司匹林联合VNR对人乳腺癌细胞MCF-7的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人乳腺癌细胞MCF-7，购自中国科学院细胞库。

1.2试药 RPMI 1640型培养基(批号20181219)，武汉纯度生物科技有限公司；Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒(批号20190113)，艾美捷科技有限公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2抗体(Bcl-2，批号2019001)，Bcl相关X蛋白抗体(Bax，批号20181203)，磷酸化丝氨酸苏氨酸激酶抗体(P-Akt，批号20190103)，丝氨酸苏氨酸激酶抗体(Akt，批号20190103)，半胱氨酸蛋白酶3抗体(Caspase-3，批号20190106)，半胱氨酸蛋白酶9抗体(Caspase-9，批号20190105)，均购自Santa Cruz Animal Health公司；阿司匹林(国药准字：J20171021)，购自阿斯利康制药有限公司；VNR(批号20190110)，购自上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜(批号20190122)，购自上海研卉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养 将MCF-7细胞培养于RPMI 1640 培养基中，置于37 ℃恒温箱中，调整二氧化碳浓度至2.23×105mol·L-1，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3.2分组及给药 本实验分为4组：空白对照组(添加等量的细胞培养液)，VNR组(VNR 10 μg·mL-1给药治疗)，阿司匹林+VNR低剂量组(阿司匹林5 mmol·L-1和VNR 10 μg·mL-1联合治疗)，阿司匹林+VNR高剂量组(阿司匹林10 mmol·L-1和VNR 10 μg·mL-1联合治疗)[6-7]。

1.3.3MTT法检测细胞的增殖情况 取处于对数生长期的MCF-7细胞，以细胞密度1×107个·L-1接种于96孔板内，分别向3个给药组加入对应药物进行治疗。培养4 h，弃去上清液，加二甲基亚砜100 μL，振荡待其充分溶解后，于24和48 h分别在490 nm波长处用酶标仪测定其吸光度值A，并计算细胞生长抑制率。

1.3.4流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化 分别使用4组相关药物处理处于对数生长期的MCF-7细胞，消化后恒温离心 5 min，加入 Binding Buffer 重悬细胞100 μL，并加入 Annexin V-FITC和PI各5 μL，混匀；孵育后加入 Binding Buffer 400 μL，用流式细胞仪检测。

1.3.5Western Blot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、P-Akt和Akt蛋白表达 采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，用Bradford调整各组蛋白浓度使一致，再经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜，密封2 h，加入Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、P-Akt和Akt抗体(1∶500)于4 ℃ 孵育过夜，加入HRP标记二抗(1∶500)孵育1 h，显色，曝光后以β-actin为内参蛋白，蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值÷内参蛋白条带灰度值。

1.4统计学方法 本研究数据分析采用SPSS 22.0，使用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，本研究所有检验均为双侧检验。

2 结果

2.1MTT观察细胞的增殖情况 见表1。由表1可知，与空白对照组比较，VNR组MCF-7细胞在24，48 h抑制率均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与VNR组比较，阿司匹林+VNR低剂量组MCF-7细胞在24，48 h抑制率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与阿司匹林+VNR低剂量组比较，阿司匹林+VNR高剂量组MCF-7细胞在24，48 h抑制率均有一定程度升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 细胞的增殖情况观察

2.2流式细胞术检验细胞凋亡率和细胞周期分布情况 见图1、图2和表2。由图1可知，空白对照组细胞凋亡率较低；与空白对照组比较，VNR组MCF-7的细胞凋亡率有一定程度升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与VNR组比较，阿司匹林+VNR低剂量组MCF-7细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与阿司匹林+VNR低剂量组比较，阿司匹林+VNR高剂量组MCF-7细胞凋亡率有一定程度升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

由表2和图2可知，空白对照组细胞各周期数量均正常；与空白对照组比较，VNR组MCF-7细胞G1期细胞减少，S期细胞增加，差异有统计学意义(P<0.05)，G2期细胞无显著变化(P>0.05)；与VNR组比较，阿司匹林+VNR低剂量组MCF-7细胞G1期显著减少，S期细胞显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，G2期细胞无显著变化(P>0.05)；与阿司匹林+VNR低剂量组比较，阿司匹林+VNR高剂量组MCF-7 细胞G1期减少，S期增加，差异有统计学意义(P<0.05)，G2期无显著变化(P>0.05)。

图1 流式细胞凋亡观察结果

图2 流式细胞凋亡周期观察结果

表2 联合用药对MCF-7细胞周期的影响

2.3相关凋亡蛋白检测 见表3和图3。由表3和图3可知，与空白对照组比较，VNR组Bcl-2蛋白表达量显著下降，Bax蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与VNR组比较，阿司匹林+VNR低剂量组Bcl-2蛋白表达量显著下降，Bax蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与阿司匹林+VNR低剂量组比较，阿司匹林+VNR高剂量组Bcl-2蛋白表达有一定程度下降，Bax蛋白表达量有一定程度升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 凋亡Bcl-2和Bax蛋白表达情况

图3 联合给药对相关凋亡蛋白的影响

2.4Caspase家族相关蛋白检测 见表4和图4。由表4和图4可知，与空白对照组比较，VNR组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与VNR组比较，阿司匹林+VNR低剂量组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与阿司匹林+VNR低剂量组比较，阿司匹林+VNR高剂量组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量有一定程度升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表4 凋亡Caspase-3和Caspase-9蛋白表达情况

图4 联合给药对Caspase家族蛋白的影响

2.5磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路相关蛋白的影响 见表5和图5。由表5和图5可知，与空白对照组比较，VNR组P-Akt蛋白表达量有一定程度下降，差异有统计学意义(P<0.05)，Akt蛋白表达量无显著变化(P>0.05)；与VNR组比较，阿司匹林+VNR低剂量组P-Akt蛋白表达量显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)，Akt蛋白表达量无显著变化(P>0.05)；与阿司匹林+VNR低剂量组比较，阿司匹林+VNR高剂量组P-Akt蛋白表达量显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)，Akt蛋白表达量无显著变化(P>0.05)。

表5 凋亡P-Akt和Akt蛋白表达情况

图5 联合给药对PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响

3 讨论

翁熊等[8]研究表明，肿瘤细胞周期停止于有丝分裂前期，能避免肿瘤细胞不断进入有丝分裂期，从而抑制其进一步发展，调节细胞周期可作为肿瘤治疗的一种重要方法。白宏等[9]研究表明，细胞周期可分为G1期、S期、G2期和M期4个时期，是高度有序的运转过程，只有在完成上一个时相后才能进入下一个时相。细胞完成每一个时相时会把不同染色体准确无误地遗传给子代细胞。这一过程中，每个误差都可能导致遗传信息的改变，从而导致肿瘤或其他疾病的发生。岳庆喜等[10]研究表明，许多抗肿瘤药物直接参与对细胞周期调控蛋白的表达调控，同时细胞增殖周期的检测是抗肿瘤作用及其机制研究的常用生物学指标。王茜等[11]研究发现，联合用药和单独给药均能抑制MCF-7细胞，使细胞阻滞在S期并抑制Akt的磷酸化。有研究发现[12]，使用流式细胞术检测阿司匹林可使MCF-7细胞阻滞于G2/M期和S期。本实验结果表明，阿司匹林联合VNR使得乳腺癌细胞的S期细胞百分比显著增高，说明联合用药可将MCF-7细胞抑制在S期，防止肿瘤细胞进入有丝分裂期从而抑制其进一步发展，这与吴颖等[13]的研究结论一致。

细胞凋亡受多种基因共同调控[14]，Caspase是重要的调控基因之一，Caspase-3和Caspase-9是Caspase家族中主要的凋亡因子[15]。Caspase-9是Caspase家族的凋亡启动子，可产生有活性的凋亡执行基因Caspase-3并剪切Caspase 底物引起级联反应促进细胞的凋亡[16]。研究发现，Caspase-3和Caspase-9表达显著升高，说明阿司匹林联合VNR作用后促进了Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达，使得细胞凋亡启动、执行和发展均受到促进。阿司匹林联合VNR使得Caspase-9表达增加，细胞凋亡子启动，促进Caspase-9裂解，使得非活化状态Caspase-3 产生有活性的 Caspase-3，其含量也增加，最终促进人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡，这与吴娟等[17]的研究结论一致。Bcl-2 家族和Caspase家族作用类似，也可调控细胞的凋亡，在Bcl-2 家族中，当Bcl-2蛋白表达下降时，Bax蛋白表达上升，此时细胞趋于凋亡，相反，Bcl-2蛋白表达升高时Bax蛋白表达则会下降，细胞的凋亡同时也会受到抑制[18-20]。本实验结果表明，Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低，说明阿司匹林联合VNR可有效促进MCF-7细胞凋亡，达到抑制乳腺癌发展的效果。

Fang W L等[21]研究表明，在癌细胞中PI3K/Akt信号通路被异常激活，其作用机制主要是PI3K催化亚单位α(PIK3CA)基因突变以及10号染色体丢失磷酸酶基因(PTEN)表达的丢失等。因此，PI3K/Akt信号通路在乳腺癌的治疗中起着十分重要的作用。目前以这条通路为作用靶点的抑制剂已成为研究热点。已知的通路抑制剂包括PI3K抑制剂、PI3K/Akt双重抑制剂和Akt抑制剂。研究显示，阿司匹林联合VNR能显著降低Akt的磷酸化，但总量改变并不显著，说明阿司匹林联合VNR促进癌细胞凋亡是通过抑制 PI3K/Akt 信号通路发挥效应，减少Akt的磷酸化，促进人甲状腺癌细胞(IHH4)的凋亡。

综上所述，阿司匹林联合VNR可通过抑制PI3K/Akt信号通路有效诱导MCF-7细胞凋亡，其作用机制既与调控Caspase家族和Bcl-2家族基因相关，也与抑制PI3K/Akt信号通路有关。VNR可联合使用的药物较多，在后续的实验中可进一步探讨其他药物联合VNR对MCF-7细胞的作用机制。