油棕叶肉原生质体分离及瞬时转化体系的建立

王一菲，刘新星，张青，郑育声，李东栋

海南大学热带作物学院,海口 570228

油棕(ElaeisguineensisJacq.)是棕榈科单子叶热带植物，它主要生产2种棕榈油和棕榈仁油，占世界油量的36%[1]。其中，棕榈油含有棕榈酸、油酸、维生素E和类胡萝卜素，具有极高的营养价值[2]。应用基因工程手段鉴定油棕中与油脂代谢相关基因的功能，进而对其脂肪酸种类和含量进行遗传修饰，对提高棕榈油的产量及改善其品质具有重要的价值。

然而，作为多年生木本植物，油棕植株再生体系周期很长，转基因植株也不易获得。因此，研究者通常将油棕基因异源表达于模式植物如拟南芥中，以研究其功能。但由于遗传背景差别太大而无法取得满意的效果。原生质体瞬时转化系统快速、高效，被广泛用于亚细胞定位、蛋白与蛋白之间的互作、蛋白与启动子之间的特异性结合等研究[3]。利用油棕原生质体进行基因的同源表达，将有效避免异源表达可能造成的差异结果。

目前，油棕原生质体的分离[4-6]及瞬时转化[7]虽然有过报道，但其原材料都是油棕胚性悬浮细胞。然而由胚性愈伤到胚性悬浮细胞要3个月[4]，耗时长。因此，本研究以油棕试管苗叶片为原材料，分离得到原生质体，并借助绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，对油棕叶肉原生质体的双质粒瞬时共转化体系进行优化，旨在为油棕基因的同源表达、功能鉴定及蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质之间的互作研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

油棕(ElaeisguineensisJacq.)试管苗幼嫩叶片(发芽后25 d)，以海南大学热带棕榈植物实验室诱导获得的油棕愈伤组织为基础，通过芽诱导获得幼嫩植株。绿色荧光蛋白载体pGreen Ⅱ 62-SK-EGFP和红色荧光蛋白载体pGreen Ⅱ 0800-DsRed2载体皆购买于优宝生物公司。纤维素酶、离析酶、MES酸和BSA购自Solarbio公司，甘露醇、PEG4000、氯化镁等购自西陇科学公司。

1.2 油棕叶肉原生质体的分离

油棕叶肉原生质体分离参照拟南芥叶片原生质体的分离方法[8]，稍有改动。将幼嫩油棕试管苗叶片切成0.5 mm宽的细丝，浸没于15 mL过滤除菌后的酶解液中。酶解液的配方为：30 g/L的纤维素酶、8 g/L的离析酶、0.4 mol/L的甘露醇、20 mmol/L 的氯化钾、20 mmol/L 的MES、10 mmol/L的氯化钙和1 g/L的BSA。然后在室温、避光、转速为60 r/min的条件下孵育3.5 h。再将其用80 μm的细胞过滤筛过滤到离心管中，加入20 mL的洗液(30 g/L KCl、5 g/L CaCl2·2H2O和36 g/L 甘露醇，pH 5.6)，2 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清。最后加入适量的悬浮液(30 g/L KCl和36 g/L甘露醇，pH 5.6)重悬原生质体，使原生质体的量为4×105/mL。

1.3 油棕叶肉原生质体的瞬时转化

油棕叶肉原生质体的转化方法参照文献[7]进行并有稍许改动。取200 μL的油棕原生质体(4×105/mL)于2 mL 的离心管，加入10 μg 的pGreen Ⅱ 62-SK-EGFP质粒和10 μg的 pGreen Ⅱ 0800-DsRed2质粒，混匀，冰上静置30 min后，45 ℃热激5 min，再于冰上静置2 min。然后室温黑暗孵育30 min，转移混合液于6孔板中。加入等量的PEG/Mg2+溶液(100 g/L 的PEG 4000和50 g/L的氯化镁)，于黑暗中静置孵育10 min。然后再加入4 mL的洗液(30 g/L KCl、5 g/L CaCl2·2H2O和36 g/L甘露醇，pH 5.6)，室温弱光诱导16 h，4 ℃、2 000 r/min离心5 min，弃上清，加200 μL的洗液重悬原生质体，在荧光倒置显微镜下观察并计算转化效率。

为了获得更高的转化效率，对转化条件进行梯度设置：pGreen Ⅱ 0800-DsRed2质粒质量设置为1.25、2.50、5.00和10.00 μg，45 ℃热激时间设置为5、10、15、20和25 min，PEG/Mg2+溶液中PEG 4000的质量浓度设为100、200、400和600 g/L，氯化镁的质量浓度设为50、100、200和300 g/L，加入PEG/Mg2+溶液后孵育时间设为10、20和30 min，最后加入的洗液体积为2和4 mL。

1.4 转化效率的计算

转化效率参照Masani等[7]的方法计算。油棕叶肉原生质体的转化完成后，取原生质体于荧光倒置显微镜下观察。转化效率=(发出荧光的原生质体数目/总原生质体个数)×100%。

1.5 统计学分析

每个样本3个平行。所有数据利用SPSS软件进行显著性分析。2组数据间的差异性检验方法为“独立样本t检验”，多组数据间的差异性检验方法为“Duncan’s multiple range test”。

2 结果与分析

2.1 油棕叶肉原生质体的分离

以再生1个月内的油棕幼芽叶片(图1A)为原材料，按本文“1.2”的方法进行操作，得到油棕叶肉原生质体(图1B)。

A. 油棕试管苗幼叶 Young leaves of oil palm plantlet； B. 油棕叶肉原生质体 Oil palm mesophyll protoplasts.

2.2 油棕叶肉原生质体瞬时转化体系的优化

1)质粒含量对油棕叶肉原生质体转化效率的影响。将10 μg的绿色荧光蛋白质粒pGreen Ⅱ62-SK-EGFP分别和1.25、2.50、5.00、10.00 μg的红色荧光蛋白质粒pGreenⅡ 0800-DsRed2，按照本文“1.3”的方法，共转入相同含量的原生质体中，计算转化效率，结果(图2A)显示，转化效率随质粒pGreen Ⅱ 0800-DsRed2含量的降低而升高，当pGreen Ⅱ62-SK-EGFP质粒为10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2质粒为1.25 μg时，转化效率最高，为0.068%。

2)PEG/Mg2+溶液的诱导时间对油棕叶肉原生质体转化效率的影响。为了研究加入PEG/Mg2+溶液的孵育时间对转化效率的影响，将10 μg的pGreenⅡ62-SK-EGFP质粒和1.25 μg的pGreen Ⅱ 0800-DsRed2质粒共转入油棕叶肉原生质体，对PEG/Mg2+溶液的诱导时间梯度设置为：10、20和30 min。结果显示，当诱导时间为20 min时，转化效率最高，为0.418%(图2B)。

3)PEG 4000质量浓度对油棕叶肉原生质体转化效率的影响。在PEG诱导的原生质体的转化体系中，PEG质量浓度是影响转化效率的重要因素之一，在质粒含量和PEG/Mg2+溶液的诱导时间都是最优的条件下，检测了PEG/Mg2+溶液中的PEG4000的质量浓度(100、200、400和600 g/L)对转化效率的影响。结果显示，当PEG 4000的质量浓度为200 g/L时，转化效率最高，为0.500%，过低或过高浓度的PEG 4000都会使转化效率降低(图2C)。

4)热激时间对油棕叶肉原生质体转化效率的影响。结果(图2D)显示，在其他转化条件皆相同，热激时间分别为5、10、15、20和25 min时，转化效率先是随着热激时间的增加而降低，当热激时间为10 min时，转化效率比热激时间为5 min的低；然而当热激时间再延长，转化效率随之升高，且热激时间为20 min时，转化效率达到最高，为0.528%；最后，当热激时间为25 min时，转化效率最低。

5)氯化镁质量浓度对油棕叶肉原生质体转化效率的影响。在质粒含量、PEG/Mg2+溶液的诱导时间、PEG4000质量浓度和热激时间都为最优的条件下，检测了氯化镁的质量浓度分别为50、100、200和300 g/L时原生质体的转化效率。从图2E可见，当氯化镁的质量浓度为100和200 g/L时，转化效率最高，为2.85%，为了节约成本，选择100 g/L进行后续实验。

6)过夜培养时液体体积对油棕叶肉原生质体转化效率的影响。在其他条件都为最优的情况下，进行了油棕叶肉原生质体的转化，然后分别加入2和4 mL的洗液进行过夜培养。结果发现当加入2 mL洗液时，转化效率最高，为4.82%(图2F)。

不同小写字母表示经Duncan’s multiple range test检验差异显著。2组数据间的差异性检验方法为“独立样本t 检验”：”*”表示显著性差异(P<0.05 )； “**”表示极显著性差异(P< 0.01)。Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) using Duncan’s multiple range test. “*” and “**” indicated significant differences (P<0.05) or (P<0.01) using independent-samples t test.

washing solution(F ) on transient transformation efficiency of oil palm mesophyll protoplasts

2.3 最优条件下油棕叶肉原生质体瞬时转化

在最优条件下即pGreenⅡ 62-SK-EGFP质粒为10 μg、pGreenⅡ 0800-DsRed2质粒为1.25 μg、45 ℃的热激时间为20 min、PEG/Mg2+溶液中的PEG 4000质量浓度为200 g/L、氯化镁的质量浓度为100 g/L、加入PEG/Mg2+溶液后的孵育时间为20 min，最后加入的洗液的体积为2 mL进行了油棕叶肉原生质体转化， 荧光倒置显微镜观察结果(图3)显示，GFP和RFP都正常表达在整个原生质体中，证明此油棕叶肉原生质体的双质粒共转化体系可行。

图3 双质粒共转化油棕叶肉原生质体

3 讨 论

原生质体由于没有细胞壁，更易于接受外源DNA，且瞬时表达周期短，能更快地获得实验数据，常被用于亚细胞定位、实时监测胞内生化反应、qRT-PCR检测基因的表达模式、验证蛋白质与蛋白质或蛋白质与DNA的互作等，对鉴定植物基因的功能有着重要意义[9]。Bai等[10]利用大麦原生质体进行了亚细胞定位，发现OsSPCH定位于细胞核，OsLrgB定位于叶绿体；同时利用qRT-PCR检测了共转miR393a和其靶基因后的大麦原生质体中靶基因的表达水平，从而证明了两者间的靶向关系。Lin等[11]利用植物原生质体检测了CRISPR/Cas9的诱变效率；同时以烟草原生质体为材料，利用CRISPR/Cas9对NtPDS进行靶向突变，最终获得突变后的再生植株。Liu等[12]通过拟南芥原生质体瞬时转化体系，鉴定出BnWRKY15和BnWRKY33都定位于细胞核；同时借助双萤光素酶报告系统，发现BnWRKY15在拟南芥原生质体中，能抑制BnWRKY33的反式激活能力。Menzel等[13]在拟南芥叶肉原生质体中通过免疫印迹法检测了flg22处理对PIP5K6磷酸化的影响。

以往报道的油棕原生质体的分离大都是油棕细胞培养物，且多用于植株再生。Bass等[5]从油棕细胞培养物中分离出原生质体，经培养后再生出细胞壁。Sambanthamurthi等[6]从多胚培养物中分离出原生质体，并培养得到微小愈伤组织。Masani等[4]由细胞悬浮培养物分离得到原生质体，并再生成植株。Masani等[7]还报道了来源于细胞悬浮培养物的原生质体的单个质粒瞬时转化体系，转化效率为4.76%。但是，获得油棕胚性愈伤需要5～10个月，由胚性愈伤到胚性悬浮细胞则又要花费3个月[4]。以细胞悬浮培养物为原材料分离原生质体将会拖慢实验进程。而油棕叶片是最为容易获得的材料，因此，本研究以油棕试管苗叶片为原材料，分离原生质体，整个过程仅需5 h。与拟南芥叶肉原生质体的分离相比[8]，油棕叶片所用酶解液中的纤维素酶和离析酶为拟南芥的2倍，可能与木本植物结构更为复杂、组织间内含物更丰富有关[14]。

分离得到油棕叶肉原生质体后，考虑到大多数实验需要同时转入2个基因，以验证两者间的关系，本研究按照Masani等[7]报道的最优体系将2个质粒(各10 μg)共转入原生质体中，然而转化效率极低，仅有0.028%(图2A)，这可能是由于原生质体来源于叶片而非悬浮细胞，且转入质粒为2个。Peng等[15]发现热激处理有利于提高籼稻原生质体瞬时转化的效率。本研究中，当热激时间为20 min时，油棕叶肉原生质体转化效率达到最高，缩减或延长热激时间都会使转化效率降低。在PEG介导的原生质体转化中，质粒的质量比、PEG浓度、PEG诱导时间对转化效率具有重要影响。当pGreen Ⅱ62-SK-EGFP质粒为10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2质粒为1.25 μg时，油棕叶肉原生质体的转化效率最高。高分子质量的PEG溶液对原生质体有毒害作用[16]，而PEG浓度过低，会导致转化效率过低，因此，PEG浓度是优化原生质体转化的关键因素。本研究中油棕叶肉原生质体转化的最适PEG4000质量浓度为200 g/L、诱导时间为20 min。Lazzeri等[17]发现，与Ca2+相比，Mg2+对PEG介导的转化有更好的促进作用。本研究对氯化镁的质量浓度进行了优化，发现其最适质量浓度为100 g/L。此外，由于过夜孵育前，加入的洗液体积会直接影响到PEG、Mg2+的最终浓度，且此浓度下的PEG和Mg2+将与原生质体一同孵育16 h，分别检测了加入2 mL和4 mL时，油棕叶肉原生质体的转化效率，发现加入2 mL时，效率更高。然而，世界范围内，鲜少报道油棕原生质体的瞬时转化，与模式植物拟南芥相比，油棕原生质体的瞬时转化体系尚不成熟。本研究在最优组合条件下，转化效率为4.82%，远低于大麦(83%)[10]、拟南芥(90%)[18]、水稻[19](53%～75%)等体系。

本研究以油棕试管苗叶片为原材料，在酶解液中的纤维素酶为30 g/L、离析酶为8 g/L时，分离得到了油棕叶肉原生质体，并对双质粒瞬时共转化体系进行了优化。最优转化条件如下：pGreenⅡ62-SK-EGFP质粒为10 μg、pGreen Ⅱ0800-DsRed2质粒为1.25 μg，45 ℃的热激时间为20 min，PEG/Mg2+溶液中的PEG 4000的质量浓度为200 g/L、氯化镁的质量浓度为100 g /L，加入PEG/Mg2+溶液后的孵育时间为20 min，最后加入的洗液体积为2 mL。此瞬时转化体系为油棕基因的同源表达提供了可能，可以用于亚细胞定位、蛋白质与DNA或蛋白质互作、基因表达模式等研究，有效地缩短了试验周期，为油棕基因的功能验证提供了一种新的手段。