克氏原螯虾sex-lethal基因的克隆与表达分析

费佳敏，石林林，李艳和,2

1.华中农业大学水产学院/农业农村部淡水生物繁育重点实验室/农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070;2.长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，武汉 430070

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称小龙虾，因其生长迅速、适应性强、肉味鲜美、蛋白质含量高等特点，目前已成为我国重要的淡水经济养殖品种之一。 在自然发育和人工养殖过程中，雌雄个体间的生长速度存在一定的差异。在达到性成熟之前，雌雄个体相差不大且生长速度相当；接近性成熟时，由于雌虾需要为卵巢提供大量的营养物质，雄虾的体长和体质量增长较雌虾快[1]。因此，研究克氏原螯虾中与性别分化相关的基因，将有利于人为控制其性别的分化，达到在养殖过程中进行单性养殖以获得更高利益的目的，并推动我国小龙虾产业的发展。

目前有关昆虫雌雄性别发育相关基因的研究已有一定的进展，其中关于黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)性别决定机制的研究最为成熟，可为其他物种的研究提供一定的参考作用。在昆虫的体细胞中性别决定信号的调控是由一系列涉及多个基因的联级反应组成的，其中一些基因编码RNA结合蛋白来控制前体mRNA的性别特异性剪接[2]，从而达到对昆虫性别分化的调控作用。在这些性别决定相关的基因中，Sxl位于联级反应的最上游，被认为是黑腹果蝇性别决定的关键基因，是控制着体细胞的性别分化、生殖细胞的分化以及剂量补偿的枢纽[3]，其表达受到X∶A的信号调控[2]。当X∶A(2X∶2A)的比值为1时，Sxl被激活产生有活性的Sxl蛋白，调控下游性别分化相关基因的表达，使果蝇个体发育成雌性。相反当X∶A(XY∶2A)为0.5时，Sxl没有被激活，一系列的联级调控反应无法进行，促使果蝇个体发育成雄性[4]。

在一些甲壳动物中，与性别决定联级反应有关的一些基因已经被报道，如，罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)的1个Sxl基因，2个Dmrt转录异构体[5]；南美白对虾(Penaeusvannamei)的Sxl基因[6]；中华绒螯蟹的(Eriocheirsinensis) 4种Sxl转录异构体[7]；红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)的4种Sxl转录异构体[8]；中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)的1个Tra-2基因[9]；日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)的2个Sxl异构体和1个Tra-2基因[10-11]。甲壳动物的这些基因大多与昆虫的同源基因具有高度的序列相似性，但是这些基因在甲壳动物的性别决定中的作用仍然没有被明确，而研究与其性别调控相关基因的结构与功能又是探明甲壳动物的性别决定机制的突破口。因此，笔者克隆和分析克氏原螯虾性别相关基因Sxl的结构和表达情况，以期为克氏原螯虾性别决定和性别分化机制的研究奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 动物材料

试验用虾来自华中农业大学水产养殖示范基地，养殖水温20～23 ℃，每天投喂2次，1周换水1次。采集健康的(20±5) g成年雌雄克氏原螯虾的腹部腹神经索、胸部腹神经索、食道下神经节、围食道神经、脑、眼柄、心、肝胰腺、胃、前肠、中肠、后肠、触角腺、肌肉、鳃、血、皮肤、精巢、输精管、促雄性腺、卵巢等21种组织样品，以及克氏原螯虾无节幼体期和蚤状幼体期的受精卵，出膜后1、3、6、13、15、17 d的整只虾样品，出膜后出现雌雄分化的23、28、36、41、48、98、103、109、115 d的雌雄虾的头胸甲样品，共计26种样品。其中每种试验样品采集3只虾为1组，采集后的样品经液氮罐速冻后于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 总RNA的提取和cDNA的合成

采用TRIZol©Reagent(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)法提取各个试验样品的总RNA。取1 μL RNA，使用紫外分光光度计NanoDrop 2000(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)进行上机检测，测定其A260/A280在1.8～2.0之间，质量浓度在20 ng/μL以上；根据反转录试剂盒ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)操作步骤对提取的总RNA(1 μg)进行反转录，以获得cDNA第一条链。剩余RNA样品以及反转录得到的cDNA样品保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3 Sxl的cDNA序列的克隆

根据NCBI数据库中已知的甲壳类动物的SxlcDNA序列，利用MEGA 5.1软件，找出其高度保守区域。遵循引物设计的原则，利用生物学软件Primer Premier 6.0设计简并引物Sxl-F/R(表1)，扩增获得Sxl基因的部分cDNA片段。基于获得的SxlcDNA的中间序列，按照SMARTerTMRACE(TaKaRa,大连)试剂盒要求，用Primer Premier 6.0设计用于扩增SxlcDNA 5′端的特异性引物Sxl5′R1/2 (Kit)以及3′端的特异性引物Sxl3′F1/2 (Kit) (表1)。根据试剂盒的方法扩增3′、5′末端未知序列。

表1 试验所用引物序列 Table 1 Sequence of different primers used in this experiment

1.4 序列分析

使用Seqman软件对序列进行拼接，得到SxlcDNA全长。用在线生物软件Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将获得的全长与其他物种的Sxl序列进行比对，用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测其ORF区，用DTU Bioinformatics (http://www.bioinformatics.dtu.dk/)和ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)推导其氨基酸序列结构特点，并分析其蛋白质分子质量和等电点，通过SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测结构域。使用DNAMAN软件的Clustal W对各物种的Sxl氨基酸序列(表2)进行比较分析。使用MEGA 5.1构建系统进化树(邻接法)，其中分支节点值(bootstrap-value)设置为1 000次重复抽样试验，检验各节点的置信度。

1.5 荧光定量PCR

基于已获得的PcSxlα、PcSxlβ、PcSxlγ和PcSxlδ4种转录异构体序列的保守区域，遵循引物设计原则，利用Primer Premier 6.0设计荧光定量PCR引物Sxl-qF/R(表1)，使用SYBR©PremixExTaqTMⅡ荧光染料试剂(TaKaRa,大连)，以及Quant Studio 6荧光定量PCR仪(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)对成年雌雄克氏原螯虾各组织以及各发育阶段的组织样品中的Sxl表达情况进行定量分析。每个样品重复3次，反应程序如下：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s；59 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s；40个循环。同时选用18S RNA为内参基因进行对照。

表2 序列比对及聚类分析所用Sxl氨基酸序列信息 Table 2 Information of Sxl used in sequence alignment and phylogeny analysis

使用2-△△Ct法分析克氏原螯虾Sxl基因在不同组织及发育时期的相对表达情况。使用生物统计学软件GraphPad Prism 7对数据进行统计分析，使用单因素方差分析和多因素方差分析的方法进行显著性差异分析。P<0.05代表存在显著性差异，P<0.01代表存在极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 克氏原螯虾Sxl基因的序列分析

从雄性克氏原螯虾精巢中扩增出了4个不同转录异构体的SxlcDNA序列，分别命名为PcSxlα、PcSxlβ、PcSxlγ和PcSxlδ，序列提交至Genbank数据库，登录号分别为MT680909～MT680912。其中，PcSxlα有102 bp 5′UTR、696 bp ORF(编码231 aa)和392 bp 3′UTR；起始密码子和终止密码子分别为ATG和TAA，3′端有1个加尾信号AATAAA；预测的PcSxlα多肽的分子质量为25.75 ku，理论等电点pI为9.06。PcSxlβ有102 bp 5′UTR、648 bp ORF(编码215 aa)和518 bp 3′UTR；起始密码子和终止密码子分别为ATG和TGA，3′端无加尾信号AATAAA，但有U元素富集区；预测的PcSxlβ多肽的分子质量为24.24 ku，理论等电点pI为9.13。PcSxlγ有102 bp 5′UTR、939 bp ORF(编码322 aa)和1 128 bp 3′UTR；起始密码子和终止密码子分别为ATG和TGA，3′端有1个加尾信号AATAAA；预测的PcSxlγ多肽的分子质量为33.97 ku，理论等电点pI为9.25，有2个N-糖基化位点N283和N293。PcSxlδ有102 bp 5′UTR、717 bp ORF(编码238 aa)和1 429 bp 3′UTR；起始密码子和终止密码子分别为ATG和TGA，3′端有1个加尾信号AATAAA；预测的PcSxlδ多肽的分子质量为26.59 ku，理论等电点pI为 9.36。这4种不同的PcSxlcDNA序列及编码的氨基酸序列具体如图1A所示。

如图1B所示，这4种不同剪接方式的PcSxlmRNA具有相同的5′UTR及部分相同的ORF。PcSxlα、PcSxlβ、PcSxlγ与PcSxlδ相比，PcSxlα只有前729 bp与PcSxlδ相同，而图1B中黄色方块区域则是与PcSxlδ不同的序列；PcSxlβ缺失了2个片段，一段在PcSxlδORF，长度为69 bp，另一段在3′端，长度为914 bp；PcSxlγ缺失77 bp，缺失的区域包含PcSxlδ的部分ORF序列和部分3′端序列。

A： 4种不同的PcSxl cDNA序列及预测的氨基酸序列。图中蓝色阴影加下划线为PcSxls的2个RRM结构域。B： PcSxl mRNA对比图。 A： The nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of PcSxl cDNA. The two RRM domains of PcSxl are indicated by blue shade with an underline. B： The comparison of PcSxls.

2.2 克氏原螯虾Sxl氨基酸序列分析

在DANMAN软件上，用Clustal W算法将测得的序列与其他物种的Sxl氨基酸序列和RRM结构域氨基酸序列分别进行多重比较分析，所得到的结果见图2A。通过多序列比较分析发现，螯虾类的Sxl氨基酸序列一致性高达75.76%；虾蟹类的高达72.24%；而整个甲壳类的一致性则为68.98%。PcSxlα与红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)的Sxl4(CqSxl4)一致性达66.47%；PcSxlγ与CqSxl1的一致性高达87.54%；PcSxlδ与CqSxl3的一致性为69.83%；而PcSxlβ与CqSxl3的一致性只有63.2%。总的来说整个甲壳类的Sxl氨基酸序列较为一致。

A：甲壳动物Sxl氨基酸序列的多重比较。彩色背景标识的氨基酸残基为保守性大于50%的氨基酸残基。克氏原鳌虾的Sxl氨基酸序列在图中用红色方框标出。 B：预测的PcSxl蛋白结构域。RRM表示RNA识别模体区，粉色方块表示低复杂区。A： The multiple-sequence alignment analyses of deduced Sxl amino acid sequences in different crustaceans. The amino acid residues identified by color background in the figure are those whose conservation is greater than 50%. The P. clarkii Sxl amino acid sequences were shown in the red box. B:The predicted domains of PcSxls. RRM represents the region of RNA recognition motif,and the pink square represents the region of low complexity.

克氏原螯虾的Sxl序列在图中用黑色三角标出。The Sxl amino acid sequences of the red swamp crayfish were shown in black triangles.

如图2B所示，在相同的ORF序列中，其对应编码的氨基酸序列包含2个RRM结构域，即这4个PcSxl转录异构体拥有相同的RRM结构域，其中1个RRM结构域包含74个氨基酸，另1个包含76个氨基酸，2个RRM结构域之间还有12个氨基酸。

使用MEGA 5.1软件对Sxl基因氨基酸序列进行系统进化分析，采用邻接法构建系统进化树，bootstrap-value设置为1 000次用于计算重复。构建的系统发育进化树如图3所示，其中，弗罗里达弓背蚁(Camponotusfloridanus)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和家蚕(Bombyxmori)3种昆虫聚为一支；淡水枝角水溞(Daphniapulex)和鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirussalmonis)又各聚为一支；整个虾蟹类单独聚为一支，而在虾蟹一支中，又分枝为螯虾类(P.clarkii和C.quadricarinatus)、对虾类(P.vannamei)、沼虾类(M.rosenbergii和M.nipponense)以及蟹类(E.sinensis和P.trituberculatus)。

2.3 克氏原螯虾Sxl在成年雌雄不同组织中的表达分析

对成年雌雄克氏原螯虾的腹部腹神经索(VN)、脑(Br)、眼柄(Es)、触角腺(AnGl)、肌肉(Mu)、鳃(Gi)、血(Hem)、精巢(Te)、输精管(TD)、促雄性腺(AG)、卵巢(Ov)等各组织的Sxl表达情况进行了分析。结果显示，Sxl在所检测的雄性和雌性组织中均有所表达，但不同的组织中存在着较大的差异(图4)。

雌雄间的差异用“*”(P<0.05)和“**”(P<0.01)表示，各组织间的差异用标字母法表示(P<0.05)。VN：腹部腹神经索；TN：胸部腹神经索；SN：食道下神经节；PN：围食道神经；Br：脑；Es：眼柄；Hea：心脏；Hep：肝胰腺；St：胃；FG：前肠；MG：中肠；HG：后肠；AnGl：触角腺；Mu：肌肉；Gi：鳃；Hem：血；Hy：皮肤；Te：精巢；TD：输精管；AG：促雄性腺；Ov：卵巢。The difference between males and females was marked by “*” (P<0.05) and “**” (P<0.01). Differences between tissues are indicated by alphabetical notation (P<0.05). VN:Ventral nerve cord; TN:Thoracic ventral nerve cord; SN:Subesophageal nerve; PN:Periesophageal nerve; Br:Brain; Es:Eyestalk; Hea:Heart; Hep:Hepatopancreas; St:Stomach; FG:Foregut; MG:Midgut; HG:Hindgut; AnGl:Antennary glands; Mu:Muscle; Gi:Gill; Hem:Hemocytes; Hy:Hypodermis; Te:Testis; TD:Testicular ducts; AG:Androgenic gland; Ov:Ovary.

从图4中可以看出，PcSxl在成年雄性克氏原螯虾的触角腺和鳃中表达量最高，其次是心脏、中肠、腹部腹神经索、后肠及肌肉组织，其他各组织PcSxl表达相对较低，特别是在眼柄和皮肤中；PcSxl在成年雌性克氏原螯虾的中肠中表达量最高，其次是前肠、肌肉和卵巢，而在其他组织中PcSxl表达相对较低，尤其是在围食道神经、眼柄和血中。此外，PcSxl在胃中的表达水平不存在雌雄差异；在雌性的前肠、中肠、皮肤和卵巢中PcSxl的表达量极显著高于雄性相应组织中PcSxl的表达量(图4)；而在触角腺和鳃及其他组织中，PcSxl在雄性组织中的表达水平要高于雌性相应组织中PcSxl表达水平。

2.4 克氏原螯虾Sxl在不同发育时期的表达分析

PcSxl在不同发育时期的表达模式如图5所示，荧光定量PCR的结果显示PcSxl在所检测的发育时期中都有所表达，其在蚤状幼体期的表达量达到高峰，出膜后的1～6 dPcSxl的表达水平量次之；并且从出膜后的第1天起其表达量整体呈现出下降趋势；在出膜后第23天和第28天，雄性幼虾的PcSxl表达水平显著高于雌性PcSxl表达水平。

NS：无节幼体；ZS：蚤状幼体；1～115 d：出膜后1～115 d。显著性差异在图中用标字母法表示(P<0.05)。NS:Nauplius stage; ZS:Zoea stage; 1-115 d:1-115 days after hatching. The significant differences are indicated by alphabetical notation (P<0.05).

3 讨 论

Sxl在黑腹果蝇中可以通过性别特异性的剪接对体细胞的性别分化起到调控作用，但是在其他非果蝇的物种，如家蚕、地中海实蝇、中华绒螯蟹中，Sxl在雌雄两性中均有表达，并且在mRNA和蛋白质表达水平上并没有明显的差异性。由此可见，Sxl的雌雄特异性剪接并不是普遍适用于其他非果蝇昆虫[12-13]。在甲壳动物中虽然有关于在同一物种中Sxl不同剪接异构体的报道[7-8]，如在罗氏沼虾中发现4种Sxl异构体，红螯螯虾中发现4种，中华绒螯蟹和日本沼虾中发现2种，而在南美白对虾中报道有6种不同异构体的存在，但是却还没有关于其存在性别特异性剪接异构体的相关报道。虽然Sxl在不同的物种中存在着不同的转录异构体以及不同的功能，但是Sxl家族蛋白在不同生物体中具有较高的同源性，均具有2个保守的RRM结构域[14-15]。在本研究中，我们从克氏原螯虾的雄性性腺中一共克隆了4种PcSxlcDNA序列，预测的氨基酸序列也具有2个保守的RRM结构域。由于这4种转录异构体的PcSxl有部分相同的序列，所以它们的RRM结构域也是相同的。在甲壳类氨基酸序列比对中发现，尽管Sxl家族蛋白在N-端和C-端部分没有明显的保守性，但RRM结构域的氨基酸序列都表现出较高的保守性，这也可以说明虾蟹类处于同一个进化水平，系统进化树显示聚为一支。

4种PcSxl转录异构体cDNA的核苷酸序列大小顺序为PcSxlα

克氏原螯虾PcSxl在成年雄性触角腺的表达量显著高于雌性的，表现出性别二态性表达。在东方岩石龙虾(Sagmariasusverreauxi)的2个性别发育相关基因SvTKIR和SvDmrt1的研究中发现，这2个基因在雌雄未成年虾的触角腺中表达水平均较高，而在成年虾的触角腺中的表达则表现出性二态性，雌性中的表达水平显著高于雄性[16]。虾蟹类的触角腺的作用类似于哺乳动物的肾脏，具有排泄和调节渗透压及离子浓度的功能[17]。有研究表明龙虾的尿液中具有一些特殊的物质，可以传达交配、聚合退敌、划分领地及其他社会行为的化学信号[18-20]。如果触角腺在克氏原螯虾中参与了这些信号的调节过程，那么也就可以解释Sxl基因在触角腺中表现出性二态性表达的现象，但目前尚未见相关报道，还需进一步深入研究。

在成年雌雄克氏原螯虾的眼柄中PcSxl的表达量均较低，这与中华绒螯蟹的EsSxl在眼柄中的表达情况相似，但是在摘除中华绒螯蟹的眼柄之后，EsSxl在雌性卵巢中的表达量下调，在雄性中出现上调的情况[7]；除此之外，PcSxl在雄性精巢中的表达量要明显低于雌性的卵巢，而在红螯螯虾中CqSxls的精巢表达量要显著高于雌性卵巢，但其在红螯螯虾中并未表现出性别特异性[8]。PcSxl在无节幼体期表达量达到顶峰，但出膜后其表达量逐渐下降；出现性别分化之后，更是表现出性别表达差异。调控雄性性别分化的PcIAG基因则是恰恰相反，在出现性别分化前表达量都较低，但是在出膜第23天，出现性别分化时，其在雄性中的表达量达到最高[20]。由此推测，在早期性别发育中，PcSxl可能直接或间接正调控下游的性别分化基因PcIAG，从而影响克氏原螯虾的性别分化。这些都可以说明克氏原螯虾中PcSxl与其性别分化相关，但其具体作用机制仍有待进一步的探究与验证。此外，本研究中各转录异构体的表达情况是否存在差异和存在不同的功能亦需要进一步的研究。