褪黑素对糖尿病大鼠心功能及氧化应激反应的影响

孙权 徐伟明 韩雪 张鹏霞 孟德欣

(1佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154002；2潍坊市坊子区仁康医院；3保山中医药高等专科学校)

当今，全球糖尿病患者已经超出2亿例，在我国糖尿病患者超过7 000万例〔1〕。糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病引起的一种心脏疾病〔2〕，主要病理特征为心肌间质增生、细胞肥大、增殖、凋亡等，临床表现主要以心脏舒张功能缺陷为主、左心室重构，随病情加重、病变进展出现心脏收缩功能异常〔3〕。氧化应激是由于多种因素刺激机体，体内产生超量的活性氧簇(ROS)；机体内抗氧化能力下降，进而机体内氧化-还原反应平衡被打破，氧化损伤严重，导致生命活动受到影响的一种状态〔4〕。糖尿病引起的高血糖和高脂肪酸能够诱导氧化应激，产生过量的ROS，高血糖所致的糖基化终末产物(AGEs)异常升高也可导致心肌细胞ROS大量产生〔5〕。ROS在体内过多产生或者消除减少，会直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性、DNA受损、细胞死亡或凋亡，造成组织损伤。褪黑素(MT)属于吲哚类激素，由松果体分泌，是具有很强的抗氧化剂，高效清除体内过多的氧自由基〔6〕，高效增强机体内超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低过氧化脂质(LPO)和血清丙二醛(MDA)存量〔7，8〕，另外可通过诱导抗氧化防御酶和抑制整个细胞凋亡，从而充分发挥其抗氧化能力，对许多疾病防治疗效甚好。本文拟分析MT对糖尿病大鼠心功能及氧化应激反应的影响。

1 材料与方法

1.1材料 体重(200±20)g，雄性Wistar大鼠(由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供)80只，清洁级，常规饲养于佳木斯大学提供的动物实验中心，每天12 h日常光照，室内气温、湿度正常，正常饮食。链脲佐菌素(STZ)由美国Sigma公司提供；MT由浙江黄岩延年褪黑素有限公司提供。

1.2分组和建立模型 大学实验动物中心适应环境性喂养1 w后，按随机分配原则分组：正常组、模型组、低剂量MT组(10 mg/kg体重)和高剂量MT组(20 mg/kg体重)，一组20只，每5只一笼饲养。

除正常组外的3组都给予高脂高糖饮食4 w后，实验大鼠禁食12 h，1%STZ 50 mg/kg体重腹腔注射，72 h尾静脉采血测血糖，在以后实验过程中每4 w测一次血糖，达到空腹血糖≥16.7 mmol/L以上，视为糖尿病大鼠模型成功。正常组按照同等剂量注射柠檬酸缓冲液。造模成功之后，每天一次10∶00～14∶00灌胃MT，低剂量MT组按10 mg/kg体重，高剂量MT组按两倍低剂量组，剩余两组给予同等剂量的生理盐水，一直持续至16 w。

1.3取材 用药前、后对空腹血糖进行测量。禁食、水12 h后，大鼠尾静脉采血，动物血糖仪测出血糖值。断髓法处死大鼠，剖开大鼠胸腔，心脏暴露眼前。顺着大鼠心底大血管根部剪断心脏，剪开心耳，心室进针，0.75%盐水冲洗，多聚甲醛固定，10%中性甲醛浸泡，蜡块包埋，制成5 μm厚石蜡切片。

1.4指标观察 ①使用生理记录仪，记录大鼠心脏左室收缩压(LVSP)、左室舒张期末压(LVEDP)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、室内压最大下降速率(-dp/dtmax)和室内压上升达最大速率所需时间(t-dp/dt)。②HE染色观察心肌组织的形态变化。③比色法测定各组心肌组织中氧化应激指标，制备10%心肌组织匀浆后，利用可见光分光光度计，测定各组心肌组织中MDA、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量的变化。

1.5统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1MT对心脏功能的影响 与正常组比较，模型组心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低、t-dp/dt升高，差异具有显著性(P<0.05)；与正常组比较，MT各组心功能LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、t-dp/dt差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，MT各组心功能LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高、t-dp/dt降低，差异具有显著性(P<0.05)，低剂量组和高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组心功能指标比较

2.2HE染色结果 普通光镜下观察结果，显示正常组心肌细胞结构清晰，排列整齐，层次鲜明，核圆形或椭圆形，染色质分布均匀，心肌间隙清晰可见，胶原纤维着色淡，分布稀疏；模型组心肌结构不清，排列杂乱，组织肿胀，细胞间质及毛细血管增生，胞体增大，大小不均，排列杂乱，胞质丰富，胞质变浅，胞核呈现长杆状，排列杂乱，核膜皱缩，核固缩，有呈双核，染色质呈颗粒状。MT处理过后心肌间隙清晰，心肌细胞排列整齐，结构清晰，胞核形态正常，染色质均匀，低剂量MT组较明显。见图1。

图1 各组心肌组织(HE，×200)

2.3各组MDA、CAT和GSH-PX含量 经过MT灌胃16 w后，与模型组比较，MT用药组MDA含量明显降低(P<0.05),CAT和GSH-PX含量明显升高(P<0.05)；而与正常组比较，模型组MDA含量显著升高，CAT、GSH-Px显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组心肌组织中MDA、CAT和GSH-PX含量测定

3 讨 论

高血糖可导致心脏胶原沉积并且诱发心肌间质纤维化程度加重，致使AGEs含量升高，心肌硬度增加，引发氧化应激增强，激活核因子(NF)-κB调控基因表达，从而改变心肌收缩能力〔9，10〕。MT通过改善胰岛素敏感性，下调胰岛素抵抗，调节心肌的代谢平衡，使其能更有效清除体内自由基，对抗心肌细胞损伤。

有学者研究表明，STZ诱导的糖尿病大鼠心肌细胞超微结构改变，心功能下降〔11〕。本实验说明MT对糖尿病大鼠心肌具有保护作用。体内的氧化应激反应是氧化与抗氧化动态平衡的破坏因素之一，导致体内炎性细胞过度浸润，氧化代谢的中间产物——ROS大量产生、聚集。ROS是导致人体衰老及各种疾病所不可忽视的因素。ROS以游离的自由基形式存在于体内，主要含有超氧阴离子(O2-)、H2O2和OH等等。机体内造成组织严重损害正是由于ROS的大量堆积，驱使细胞凋亡。氧化系统和抗氧化系统共存于机体内，抗氧化系统包括两大类：一是酶类系统，包括SOD、CAT、GSH-PX等；一类是非酶类系统，有GSH、金属硫蛋白(TM)、维生素C等，还包括微量元素硒、锌和铜等〔12〕。抗氧化系统直接或间接地降低ROS含量，如CAT主要分解体内的H2O2，降低含量，降低细胞损伤。CAT属于酶类ROS清除剂，存在于动物机体组织细胞内，动物肝脏内浓度最高，成为防御体系的重要酶，催化H2O2分解成H2O与O2，使机体细胞免于遭受H2O2的毒害；GSH-PX广泛存在机体内，是重要的体内过氧化物分解酶，硒半胱氨酸是GSH-PX的活性中心。包括组织GSH-PX、血浆GSH-PX、磷脂氢过氧化物GSH-PX和胃肠道专属性GSH-PX等四种。CAT和GSH-PX都是生物机体内研究抗氧化的重要指标。而MDA是机体内重要的氧化常用指标，MDA是机体氧化代谢的终产物，自由基作用于脂质后发生过氧化反应，可引起蛋白质、核酸等生命大分子发生交联聚合，具有细胞毒性。MDA也会影响线粒体呼吸链复合物和线粒体内关键酶的活性，加剧质膜损伤。

MT是机体天然抗氧化剂，由松果体分泌，可以自由通过细胞膜，清除自由基可以增强体内抗氧化酶类的活性。MT与膜上受体结合后，由第二信使如环磷酸腺苷(cAMP)介导使胞内磷酸化级联反应激活相关蛋白，调节抗氧化酶的活性，并影响相关基因的表达。当主动切除松果体后，导致大鼠体内的ROS基团堆积、活性上调、增强氧化应激反应〔13〕。而Kornelia 等〔14〕给予患者外源性MT 1个月后，MDA浓度下降，证明MT可以改善2型糖尿病患者体内的氧化应激反应的状态。研究表明给予糖尿病患者外源性MT 2个月后，MDA浓度下降，血浆和胞质中GSH-PX活性增加，氧化应激反应水平减缓，空腹血糖和糖化血红蛋白水平明显改善〔15〕。Geeta等〔16〕给予STZ诱导的糖尿病大鼠外源性MT后，发现MT可让部分坐骨神经的传导速度得到一定恢复，并明显降低血清内MDA含量，降低了体内氧化应激反应，MT能改善糖尿病患者神经病变得到了进一步的证实。综上，给予外源性MT可以对抗体内增强的氧化应激反应，可以保护细胞，缓解细胞所受伤害，抵抗机体的应激。MT可通过多条件途径抑制糖尿病心肌细胞中的过度氧化应激状态，从而减轻糖尿病大鼠心肌损伤程度。

致谢：感谢黑龙江省北药与功能食品优势特色学科建设项目的大力支持。