不同菌量感染大鼠尿路对尿道上皮组织CNF1、CD36蛋白表达水平的影响

金海 袁文常 詹铀超 方容 伍慧妍 彭亮

(广州医科大学 1附属第五医院，广东 广州 510700；2金域检验学院)

尿路感染是临床常见的感染性疾病，可由多种病原体引起，其中80%患者均由尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)感染引起〔1〕。UPEC具有特殊的结构如菌毛、鞭毛及分泌毒力因子决定了其致病能力，黏附宿主上皮细胞的能力是致病性的最重要因素〔2〕。另外有证据表明UPEC菌量也是尿路感染的重要条件，高剂量的细菌可破坏膀胱本身的防御，大大提髙感染的成功率〔3〕。Yang等〔4〕认为细胞毒性坏死因子(CNF1)能够下调巨噬细胞CD36的转录而诱导急性尿路感染炎症反应，CNF1与CD36蛋白与尿路感染密切相关。目前尿路感染主要以药物治疗，这些药物主要针对细菌附着、细菌毒素和蛋白酶、铁载体、脲酶、菌毛为靶标〔5〕，抗生素为主的治疗药物具有耐药、副作用大等局限性，因此为研发新型有效的药物开展相关尿道感染发病机制研究具有重要的意义。本实验通过建立大鼠尿道感染模型，旨在观察不同菌量感染大鼠尿道对尿道上皮组织CNF1、CD36蛋白表达水平的影响，了解菌量与CNF1蛋白和CD36蛋白之间的联系，初步探讨尿道感染的可能致病机制，为今后研究UPEC的尿道感染诊治提供可靠的理论基础。

1 材料与方法

1.1主要实验材料 实验大鼠及菌种：6～8周龄雌性SD大鼠50只，体重为(200±10)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2020-0001，实验符合动物伦理委员会的标准。大肠埃希菌ATCC 25922菌株购自美国模式培养物集存库ATCC。

主要实验试剂：无水乙醇和二甲苯均购自国药集团化学试剂有限公司，磷酸盐缓冲液(PBS)、电镜固定液、乙二胺四乙酸(ETDA)抗原修复液均购自谷歌生物科技有限公司，PCR引物由中国广州锐博生物科技有限公司合成，PCR逆转录试剂盒购自美国Thermo公司，总RNA提取试剂盒购自中国北京百泰克生物技术有限公司，苏木素购自美国Sigma-Aldrich公司。

主要实验仪器：石蜡病理切片机(型号：RM2016)和超薄切片机(型号：UC7)均购自上海铁卡仪器有限公司，移液枪(型号：KE0003087)购自Dragon公司，电子显微镜(型号：Tecnai G220 TWIN)购自美国FEI公司，光学显微镜(型号：TS2)购自日本宁康生物公司。逆转录扩增仪购自美国Bio-Rad公司，实时荧光定量PCR仪(型号：7500)购自美国ABI公司，紫外分光光度计(型号：Nano Photometer)购自德国Implen公司。台式高速离心机购自美国Eppendorf Centrifuge公司，组织匀浆仪购自北京柏莱斯特科技有限公司，凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2菌种复苏和计数 取冻存的菌株接种于LB培养基平板上，37℃恒温培养24 h，取单个菌落接种于液体培养基中静置培养18 h作为计数的菌种。将上述培养的菌液用生理盐水按101、102、103、104倍数进行稀释，用无菌培养皿分别装1 ml上述浓度菌液，在培养皿中加入9 ml无菌固体培养基混匀，置于37℃恒温箱中培养24 h，进行细胞计数，以菌落数接近于100为准，计算每毫升的菌落数。

1.3尿道感染模型建立及分组 随机选取10只大鼠用作空白对照(对照组)，40只用于建立尿道感染模型，模型建立参照参考文献〔6〕：SD大鼠禁水过夜后以水合氯醛深度麻醉，在生物安全柜内用酒精消毒尿道口，使用硬膜外导管经尿道进入约3 cm到达膀胱，排空膀胱内残留尿液，将配好的不同梯次的UPCE菌液注入膀胱，其中菌量分别为101CFU(101CFU组)、102CFU(102CFU组)、103CFU(103CFU组)和104CFU(104CFU组)，注入后用回形针夹住尿道口2～3 h后松开尿道。感染5 d后，测定各组大鼠的相关指标。

1.4观察指标

1.4.1大鼠尿道上皮组织与尿液细菌定量 取大鼠感染5 d后尿液，用直接稀释涂板定量方法来测定大鼠尿液细菌含量。在无菌操作环境中取大鼠中断尿道上皮组织1 g，加入1 ml生理盐水置入研磨器中，研磨成浆后用101、102、103、104倍数生理盐水进行稀释，分别取上述经不同倍数生理盐水稀释后的菌液各1 ml放入无菌平皿中，向各平皿中加入冷却至45℃的无菌培养基9 ml，使培养基与菌液混匀，待凝固后，置于37℃恒温箱中培养24 h，计算细菌菌落数。

1.4.2qRT-PCR 检测大鼠尿道上皮组织CNF1、CD36 mRNA相对表达量 在无菌操作环境中，取1 g大鼠中段尿道上皮组织用研磨器研磨成匀浆，再用裂解液裂解组织，采用 Trizol 法提取组织总 RNA，将 mRNA 逆转录为cDNA，设置反应条件如下：37℃ 15 min(反转录反应)，85℃ 5 s(反转录酶的失活反应)，4℃ 15 min(稳定)。qRT-PCR 检测CNF1、CD36 mRNA相对表达量。PCR程序如下：95℃预变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共 40 个循环，结果以 2-ΔΔCt法表示。CNF1、CD36及内参GAPDH的引物序列如下：CNF1上 游引物5′-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3′，下 游引物5′-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3；CD36上游引物5′-ATGAGACTGGGACCATCGGC-3′，下 游引物5′-CAACAAACATCACTACTCCAACACC-3′；GAPDH上游引物5′-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3′，下 游引物5′-GCCCAGGATGCCCTTTAGTG-3′。

1.4.3Western印迹检测大鼠尿道上皮组织CNF1、CD36蛋白相对表达量 在无菌操作环境中，取1 g大鼠中段尿道上皮组织用研磨器研磨成匀浆，再用裂解液裂解组织，提取组织总蛋白，使用 BCA 蛋白定量试剂盒对提取的总蛋白进行定量，按比例加入 4×蛋白上样缓冲液，95℃变性5 min，置于-20℃冰箱保存备用。设置浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为100 V进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转印。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用TBST洗膜5 min，共 3 次，加入到 2%牛血清白蛋白(BSA)(TBS 配制)封闭液中进行封闭，室温摇床孵育 2 h。洗膜后先后加入一抗工作液和二抗工作液进行一抗孵育和二抗孵育。将新鲜配制的电化学发光(ECL)液滴加到 PVDF膜表面，转移至成像分析系统暗箱中曝光，采集图像并分析。蛋白定量：以相对光密度值代表蛋白表达量，以 GAPDH 为内参进行分析，实验至少重复3次。利用 Western印迹检测CNF1、CD36蛋白相对表达水平。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、LSD检验、Pearson分析。

2 结 果

2.1不同菌量感染对大鼠尿道上皮组织与尿液菌量的影响 各组尿道上皮组织和尿液菌量均有明显差异(均P<0.05)，且尿道上皮组织和尿液菌量在101CFU组、102CFU组、103CFU组、104CFU组中依次升高，两两比较均有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 不同菌量感染对大鼠尿道上皮组织与尿液菌量的影响

2.2不同菌量感染对大鼠尿道上皮组织CNF1 mRNA和CD36 mRNA表达水平的影响 对照组、101CFU组、102CFU组、103CFU组和104CFU组中，CNF1 mRNA蛋白表达水平依次升高，CD36 mRNA蛋白表达水平依次降低，两两比较均有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 不同菌量感染对大鼠尿道上皮组织CNF1 mRNA和CD36 mRNA表达水平的影响

2.3不同菌量感染对大鼠尿道上皮组织CNF1和CD36蛋白表达水平的影响 对照组、101CFU组、102CFU组、103CFU组和104CFU组中，CNF1蛋白表达水平依次升高，CD36蛋白表达水平依次降低，两两比较均有统计学差异(P<0.05)。见图2，表3。

图2 Western印迹检测CNF1、CD36蛋白表达

表3 不同菌量感染对大鼠尿道上皮组织CNF1和CD36蛋白表达水平的影响

2.4大鼠尿道上皮组织和尿液菌量与CNF1和CD36蛋白表达相关性 尿道上皮组织菌量与CNF1蛋白及其mRNA呈正相关(r=0.861，0.835；P=0.000)；尿道上皮组织菌量与CD36蛋白及其mRNA呈负相关(r=-0.808，-0.887；P=0.000)；尿液菌量与CNF1蛋白及其mRNA呈正相关(r=0.854，0.842；P=0.000)；尿道上皮组织菌量与CD36蛋白及其mRNA呈负相关(r=-0.825，-0.885；P=0.000)。结果提示尿道上皮组织和尿液菌量与CNF1表达呈正相关，与CD36表达呈负相关。

3 讨 论

大肠埃希菌ATCC 25922菌株是临床尿路感染患者体内分离株，具有较高的致病能力，此外大肠埃希菌ATCC菌株毒力特点和基因组的相关基础研究丰富〔7～9〕，代表性较强，因此本实验使用其作为尿路模型感染的病原体。在实验建模过程中，为减少手术创伤及其他病原体感染腹腔影响本次实验结果，在严格无菌的环境采用无创方法，用导管插入尿道直接膀胱灌注培养的菌液，很大程度上减少组织炎症反应，而且操作简单。毛鑫等〔6〕研究认为建模3 d后大鼠尿路感染模型的感染程度最高，而预实验中利用同样的方法建模时显示尿路含菌量在感染5 d后达到高峰，结果差异可能是由于选用的动物品种、动物年龄及大肠埃希菌菌株不同造成的。建模5 d后，建模各组的大鼠尿道上皮组织及尿液均检测到UPEC，结果提示两者菌量高低与UPEC感染量相关。

许多病原菌对宿主三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白产生毒力因子，特别是Rho家族的小GTPas1和GTPas2。在活性GTP结合构象和非活性二磷酸鸟苷(GDP)结合构象之间的转换中，Rho家族小分子鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)对调节肌动蛋白细胞骨架和其他细胞功能具有重要的作用，如细胞周期、极性、迁移、胞质分裂、增殖、凋亡和存活〔10〕。病原菌通过激活或抑制Rho-GTPase的功能，破坏宿主上皮屏障〔11〕。CNF1是UPEC产生的一种毒素蛋白，其可通过诱导谷氨酰胺去酰胺作用激活宿主真核细胞中Rho家族的小GTPase，从而干扰多种细胞功能〔12〕。此外还有研究显示CNF1通过受体介导的内吞作用与上皮细胞表面结合后被内化，CNF1在干扰宿主细胞周期中起着重要作用〔13〕。在高血压性视网膜病变大鼠模型中，抑制CNF1产生可减轻视网膜胶质增生并改善视觉表现〔14〕。有报道指出抗溶血素和CNF1的抗体可减轻产毒性尿致病性大肠杆菌尿路感染小鼠的膀胱炎症〔15〕；大肠杆菌α-溶血素可对抗Rho-GTPase激活毒素CNF1在菌血症期间引发的抗毒性天然免疫反应〔16〕。基于以上研究可知，CNF1激活Rho-GTPase的功能，从而破坏宿主上皮屏障引起尿路感染。本实验结果符合高菌量产生高毒素蛋白的理论，结果证实了UPEC感染量可直接影响CNF1的表达。CD36是一种重要的清道夫受体，负责清除病原菌和凋亡细胞，在宿主免疫防御和体内平衡中发挥重要作用〔17〕。研究显示，炎症与CD36作用高度相关，CD36可在炎症反应诱导下加重肾脏损伤作〔18,19〕，CD36表达异常易造成尿路感染〔4,20〕。实验结果体现出了CNF1下调CD36表达的结果〔4,20〕。

综上所述，感染大鼠尿路菌量越高，其尿道上皮组织菌量、尿液菌量和CNF1表达越高，CD36表达越低，尿道感染可能与高菌量影响CNF1和CD36表达相关。