拉曼检测系统中微量试样自动混匀控制装置设计与试验

闫 帅 李永玉 彭彦昆 韩东海 刘亚超

(1.中国农业大学工学院， 北京 100083； 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院， 北京 100083)

0 引言

拉曼散射是一种分子散射光谱，可以反映分子机构的振动和转动，具有特异性“指纹式”分子识别能力[1]。当分析物分子在增强基底金银等粗糙金属表面吸附时，入射激光冲击金属粗糙表面产生的局部表面等离子体共振可以显著提高分子的拉曼散射效应，从而获得高灵敏度的表面增强拉曼光谱[2-3]。解析表面增强拉曼光谱可以实现体系中目标物的定性和定量分析，目前在生物、化学、食品安全检测等诸多领域已有研究和应用[4-10]。

表面增强拉曼光谱具有高度的敏感性、强大的特异性分子识别能力和不受水环境干扰的特点，只需微量液态样品即可实现痕量检测[11-13]。在拉曼光谱检测过程中，拉曼散射受到分析物在底物表面吸附效果的影响，若无法保证有效均匀的表面吸附，则难以保证表面增强拉曼光谱的重复性和稳定性[14]。表面增强拉曼散射强度由金属表面的局部电场强度、增强区内分析物的数量以及激光功率、光斑大小等因素决定[15]，表面增强剂与样品混合的时间和均匀性差异极易造成表面增强“热点”的分布不均，直接影响拉曼光谱检测稳定性。另外，激光光源到样品表面的微小距离变化将导致样品表面激光功率以及激光斑点大小的差异[16]，对拉曼光谱稳定性影响也较大。目前，表面增强拉曼检测中增强剂和液态样品的混合吸附过程一般均人为操作，受主观因素的影响，难以保证样品和增强金属粒子混合吸附程度的均一性和操作过程时间的一致性。自动控制表面增强剂和微量液态样品的混匀吸附过程、提高表面增强拉曼光谱稳定性对表面增强拉曼光谱定量分析具有重要意义。

本文以提高表面增强拉曼光谱重复性为目的，为保证分析物和增强金属纳米颗粒混合吸附的均一性，基于实验室自行搭建的拉曼光谱点检测装置，设计微量液态样品和表面增强剂自动混匀控制装置，开发基于NI LabVIEW的上位机软件，实现微量液态样品和表面增强剂自动混匀进样、吸附时间及光谱采集自动控制等功能。以市售蜂蜜中硝基呋喃妥因、磺胺甲氧哒嗪两种兽药残留为检测对象，通过试验验证检测系统的稳定性和可靠性，以期为液态样品表面增强拉曼光谱快速定量检测提供技术支持。

1 自动混匀控制拉曼光谱检测系统设计

1.1 系统组成及检测原理

表面增强拉曼光谱信号的稳定性与重复性受试样与表面增强剂混匀吸附均一性影响，控制微流体的混合过程对于定性、定量分析至关重要。本文基于实验室自行搭建的拉曼光谱点检测装置[17]，设计表面增强剂与微量液态样品自动混匀控制装置，旨在确保液态样品和表面增强剂混匀吸附均一性，提高表面增强拉曼光谱的稳定性和重复性。所设计的表面增强剂与微量液态样品自动混匀控制装置通过拉曼检测探头与拉曼光谱点检测装置相连，即通过支架将拉曼光谱点检测装置的拉曼探头固定于自动混匀控制装置的样品槽上方激光焦距处(7.5 mm)，探头通过分叉光纤分别与激光器、光谱仪相连；CCD相机和自动混匀装置通过USB数据线与计算机通信，上位机软件进行光谱信号处理与控制混匀装置机械动作，如图1所示。

样品槽中添加试样和表面光增强剂后，通过自动混匀装置上的机械按钮或上位机软件中开始检测按钮一键式触发检测过程。进出样模块的步进电机驱动旋转台带动试样由进样口传送至检测口，同时混匀模块通过偏振电机高速旋转造成样品板的振荡使样品槽中的试样液滴与表面增强剂充分混匀吸附。控制模块通过串口通讯控制单片机和接收单片机反馈信号，识别按钮触发，驱动步进电机驱动器和直流电机驱动器从而控制进出样模块与混匀模块。当试样到达检测位置且完成设定时间的振荡混匀后，单片机向上位机反馈信号，上位机控制拉曼光谱点检测装置采集光谱数据。各模块的结构及连接关系如图2所示。

1.2 硬件设计

根据连续多次测样、自动化、微量试样混匀、控制简单的思路，分别设计了进出样模块、混匀模块、控制系统模块。根据光学检测需要屏蔽外部光信号干扰的要求，将3个模块集成于金属壳体中，其中控制模块的电气部分与机械部分相互隔离，如图3所示。装置外侧设计了样品架便于试样的存放，整个装置的各部件灵活可调，拉曼探头与支架以及检测孔处的连接固定处设计了软接触保护，以免损伤光学器件。自动混匀装置加工实物如图4所示，整体尺寸(长×宽×高)为300 mm×200 mm×250 mm，便于光谱仪间的移植使用。

1.2.1进出样模块

进出样模块主要完成样品输送功能，包括样品板、电控旋转台、步进电机、工位调节手轮、旋转体5个部件，如图5所示。为实现连续批量的测样功能，采用了多样品槽设计。样品板顶面均匀分布了两周半球形样品槽，每周30个，通过滑板与滑槽的设计，可精确控制两周样品槽的切换利用。样品板通过螺钉固定，简单可靠，方便更换，加工多个样品板更换使用，保障了足量样品的检测能力。为检测过程的连续与自动化，使用了电控旋转台。利用高精度电控旋转台，根据设置时间精确控制样品槽在进样口与检测孔之间的转移，保证试样滴加后操作时间的一致性，同时避免了样品在激光下长时间照射造成的过热、灼烧问题。表面增强剂与试样的混合吸附时长对采集光谱信号稳定性和重复性影响非常大，同一样品的表面增强拉曼光谱信号随时长变化如图6所示。

另外，光谱采集过程中激光拉曼探头与检测试样的距离应保持在激光焦距约7.5 mm，而且应避免外界光的干扰，将进样槽设置在检测孔180°方向，通过电控旋转台的旋转实现样品输送，如图7所示，整个检测过程小于30 s。步进电机连续运行会造成累积误差，设计在装置壳体外的工位调节手轮可微调因累积误差造成的样品槽位置偏移。

1.2.2混匀模块

目前常用的混匀装置为机械振摇式，通过电机带动偏振块高速旋转振摇达到分散混匀的目的。然而现有的机械混匀装置体积大、功能单一，难以实现微量物质的混合操作，无法满足表面增强拉曼光谱检测中微量试样和增强剂均匀混合的需求。

混匀模块通过固定于振动平板的微型直流电机带动偏振子高速旋转产生振荡，振荡经3根连接振动平板与样品板的传振立柱传导，引发样品槽内液体的快速波动，使原本上下分层的粘稠液滴快速融合吸附。如图8所示，混匀后的液面平整，能避免人工混合造成的液面变化，有利于消除因激光斑点大小差异造成的拉曼散射信号强度变异。

混匀模块整体设计为旋转体，以满足连续检测的需求。振荡的发生与消除在中空的旋转体内部，振源部分采用悬浮式设计，利用压缩弹簧将振动平板支持固定于旋转体壳体上的沉头孔内。考虑振动平板的大小以及传振立柱的分布，上下各采用3根0.6 mm×11 mm×30 mm的不锈钢压缩弹簧，经试验验证可有效吸收激振，消除噪声与壳体振动。振动平板、传动立柱的材料选用聚甲醛(POM)材料，强度、刚度高，弹性好，质量轻。选用的5 V直流高速偏振电机作为振荡源，体积小，易驱动，满足样品槽中微量液态试样的混匀需求。电机导线通过旋转体底部的空槽引出，并通过导电滑环连接外部电路，避免了因连续旋转造成导线缠绕卡死，保证了设备的连续运行。

1.2.3控制模块

控制模块连接整个系统，并控制完成整个检测过程，由计算机、单片机、步进电机驱动器、直流电机、直流电机驱动器、降压板以及若干开关按钮组成，如图9所示。因SH-215B型高性能细分驱动器的供电电源为24 V直流电，选用了24 V直流电源适配器，并通过直流可调降压稳压板对5 V直流电机驱动器与单片机供电。STC89C52RC单片机编程简单，价格便宜，单片机通过USB数据线与上位机进行串口通讯、控制按钮功能以及驱动电机工作，从而实现了装置的控制。

1.3 系统控制软件

基于NI LabVIEW软件开发工具，基于G语言编写了上位机控制软件，软件图形界面如图10所示。上位机软件可设定相关光谱采集和振动混匀时间参数，同时具备触发采集、数据存储和光谱显示功能。上位机控制软件和下位机自动混匀控制装置的控制流程如图11所示。上位机首先判断下位机开关按钮状态，当开关按钮闭合时，触发上位机开始检测按钮，或者通过上位机软件操作界面直接触发开始检测按钮。开始检测按钮触发后，上位机向单片机发送开始检测信号，单片机接收信号后向步进电机驱动器发送脉冲，步进电机驱动器驱动步进电机旋转进样，同时转换直流电机驱动器信号端口电平向直流电机供电混合样品。达到设定振动混匀时间后，上位机向单片机发送指令，单片机控制直流电机驱动器信号引脚电平转换，振动停止。当单片机完成发送指定的步进电机驱动脉冲数后，向上位机发送到位信号，上位机控制光谱采集系统获取光谱信息，并实时显示在上位机界面。完成设定积分次数后，上位机向单片机发送信号，单片机向步进电机驱动器发送指定数量的脉冲，驱动步进电机旋转到下一个空样品槽位置，等待下一次进样。上位机完成光谱数据处理后，显示预测值并复位开始检测按钮。

2 自动混匀控制拉曼光谱检测系统试验

2.1 试验材料与方法

2.1.1试验材料

于北京美廉美超市购买某品牌枣花蜂蜜，用于不同浓度兽药残留样品的制备。硝基呋喃妥因(高效液相色谱大于98%)、磺胺甲氧哒嗪(高效液相色谱大于98%)购于上海源叶生物科技有限公司，用于兽药拉曼特征位移的确定以及样品的加标。

2.1.2试验方法

样品制备：利用硝基呋喃妥因和磺胺甲氧哒嗪标准品分别配制质量比为20 mg/kg的硝基呋喃妥因和磺胺甲氧哒嗪水溶液，将配制好的药品溶液逐级稀释并按照质量比1∶1与蜂蜜混合，分别制备硝基呋喃妥因、磺胺甲氧哒嗪质量比范围在0～10 mg/kg的蜂蜜样品各39个。

表面增强剂制备：根据Lee-Meisel经典方法[18]制备银溶胶，置于4℃冰箱中避光保存备用。

光谱采集及预处理：实验室自行搭建的拉曼点检测装置，设定曝光时间为1 s，激光功率为120 mW，手工操作采集蜂蜜样品的表面增强拉曼光谱。然后将表面增强剂与试样自动混匀控制装置与拉曼点检测装置相连，设定振动混匀时间为7 s，保持同样的曝光和激光功率，采集蜂蜜样品的表面增强拉曼光谱。所获光谱均利用Matlab R2016进行Savitzky-Golay(S-G)5点平滑和标准正态变量变换(SNV)预处理。

2.2 试验结果与分析

2.2.1蜂蜜中两种兽药拉曼特征位移的归属

2.2.2两种兽药拉曼特征峰值稳定性比较分析

分别采集硝基呋喃妥因和磺胺甲氧哒嗪质量比为2.5、5、7.5、10 mg/kg的蜂蜜样品表面增强拉曼光谱，对比使用自动混匀控制装置前后采集的兽药拉曼特征峰值稳定性以验证装置使用效果。每个浓度的样品分别重复试验10次，采集的蜂蜜表面增强拉曼光谱均经过S-G与SNV预处理，其中硝基呋喃妥因预处理后的光谱曲线如图14所示。经对比分析，自动混匀控制装置使用前兽药拉曼特征峰值强度在每个浓度分布离散，峰值强度与浓度的相关性较差，而使用自动混匀控制装置后，采集的兽药拉曼特征峰值强度和浓度之间具有明显的正相关关系，且每个浓度所获取的峰值强度分布集中，图15为不同浓度的硝基呋喃妥因表面增强拉曼特征峰值强度箱线图。另外，使用自动混匀控制装置后，所获硝基呋喃妥因和磺胺甲氧哒嗪拉曼特征峰值在不同浓度下变异系数明显优于仅使用拉曼点检测装置采集的结果，其中硝基呋喃妥因1 353 cm-1处的平均峰值变异系数降为0.032 2，1 612 cm-1处的平均峰值变异系数降为0.04；磺胺甲氧哒嗪833 cm-1处的平均峰值变异系数降为0.036 1，1 124 cm-1处的平均峰值变异系数降为0.064 9。其中，硝基呋喃妥因拉曼特征峰值强度变异系数统计结果如表1所示。结果表明使用自动混匀控制装置显著提高了采集光谱数据稳定性，减小了因人工操作造成的误差，有利于后续蜂蜜中硝基呋喃妥因定量预测分析。

表1 蜂蜜中硝基呋喃妥因表面增强拉曼特征峰值强度变异系数Tab.1 Coefficients of variation of SERS characteristic peaks intensity of nitrofurantoin in honey

2.2.3蜂蜜中兽药定量预测模型建立

表2 蜂蜜中兽药残留一元线性回归模型的校正集和验证集结果Tab.2 Calibration and prediction results of linear regression model of veterinary drug residues in honey

3 结论

(1)设计了表面增强剂与试样自动混匀控制拉曼光谱检测硬件系统，系统主要由拉曼光谱点检测装置、表面增强剂和微量液态样品自动混匀控制装置及数据处理部分组成。该系统保证每次检测样品与增强剂的均匀混合吸附条件的一致性，提高了表面增强拉曼光谱重复性。

(2)基于NI LabVIEW软件开发工具，采用G语言编写了实时控制分析软件，实现了微量液态样品和表面增强剂自动混匀进样、光谱采集及数据处理等一键式操作，通过上位机与下位机均可一键完成检测。

(3)通过试验验证了表面增强剂与试样自动混匀控制拉曼光谱检测系统的稳定性。通过对比发现，利用表面增强剂与试样自动混匀控制拉曼检测系统采集的硝基呋喃妥因拉曼特征平均峰值强度变异系数降为0.04以下，显著提高了拉曼光谱稳定性。蜂蜜中硝基呋喃妥因和磺胺甲氧哒嗪两种兽药的最佳一元线性回归模型验证集决定系数分别为0.961 9与0.979 0，均方根误差为0.672 3 mg/kg与0.518 6 mg/kg，说明自动混匀装置在提高光谱稳定性的同时，能够实现蜂蜜中兽药残留的定量预测。