水稻内生菌研究进展及展望

刘江苇,刘 颖,徐 婷,卜志刚,刘选明,朱咏华

(湖南大学生物学院,中国湖南长沙410082)

水稻作为全球一半以上人口的口粮,是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一[1]。随着全球经济的迅速发展,人类生活水平的不断提高,人们对优质稻谷的需求也随之增加,因此,越来越多的研究者致力于研究和生产品质好与产量高的稻米。而病虫害如稻飞虱、稻瘟病,气候变化如缺水、干旱等,都能够造成稻米减产和品质降低[2～3]。为了缓解这些病害和气候变化所带来的不利影响,植物内生菌逐渐进入了研究者的视野。植物内生菌是指全部阶段或部分阶段生活在健康植物细胞内或细胞间隙的微生物资源[4],它们对宿主植物的作用分为有益、中性和有害3个方面[5]。自从德国植物病理学家De Bary于1866年提出内生菌(endophyte)的概念以来,越来越多的内生菌被研究者们从不同植物的各个组织中分离出来[6]。内生菌不仅能够通过分泌1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)脱氨酶、植物激素等物质促进植物生长,还可以分泌一些水解酶、抗生素、生物碱等物质帮助植物抵抗病虫害,使植物在逆境中更好的生存,最终提高水稻的产量和品质,因此内生菌的研究成为了国内外的热点。

在长期的进化过程中,大部分内生菌与宿主形成了互利互惠的关系,并建立起了复杂又巧妙的互作机制[7]。因此,研究二者之间的互作关系、作用模式与机理,能为我们了解内生菌并加以应用提供理论依据。

目前,研究者们的目光主要集中在内生菌的多样性及内生菌与宿主植物的互作等方面,本综述主要对水稻内生菌的多样性及其与水稻的相互作用进行了概括,并对未来水稻内生菌的研究方向进行展望。

1 水稻内生菌的多样性

随着分子生物学技术的发展和检测手段的不断提高,微生物检测的灵敏度越来越高,这使得内生菌的多样性研究成为内生菌研究领域的重要组成部分。内生菌的多样性主要表现在分布多样性和自身种类的多样性。根据种类的多样性,内生菌又分为内生细菌、内生真菌与内生放线菌。研究水稻内生菌的多样性不仅可以解析水稻体内的菌群结构及其变化规律,还能为功能菌株的筛选和应用提供理论依据。

1.1 水稻内生细菌

内生细菌是水稻有益菌的一个重要类群[8],其繁殖速度快,易于培养。目前,关于内生细菌的报道主要是研究不同地区及不同品种水稻体内内生细菌的群落特性。实际上,水稻的种植环境以及生长发育时期都对内生细菌的多样性有着极其重要的影响[9～10]。Bertani等[8]从淹水和干旱条件下生长的水稻的根、叶、茎中分离得到228株内生细菌,经多样性分析发现,淹水条件下的水稻相比干旱条件下的水稻体内定殖着更多的内生细菌。Ferrando等[11]发现,在淹水前,水稻根部的内生细菌以β变形杆菌为主,而淹水后的优势内生细菌则变为γ变形杆菌。内生细菌对水稻的生长发育时期和组织部位也具有选择性,比如:灌浆时期的水稻内生细菌多于分蘖期和抽穗期[8];相较于根部和茎部,水稻叶部的内生细菌物种最丰富,但参与植物各种代谢调控的细菌主要集中在水稻根部[12]。Rashid等[13]在15种不同的土壤条件下种植同一种番茄,随后从番茄中分离到了不同类型的内生细菌,进一步证实了内生细菌的多样性与种植环境有关。此外,植物自身的基因型也能够影响植物内生细菌的多样性[14～15]。Walitang等[16]对韩国RDA试验田中6种不同水稻品种的种子内生菌进行鉴定,发现在相似种植环境下,不同水稻品种种子中的内生细菌的组成取决于水稻自身的基因型。综上可知,内生细菌的多样性与多种因素相关。

1.2 水稻内生真菌

1898年,Vogl[17]首次从黑麦中分离出内生真菌,随后,关于内生真菌的研究在不同领域展开[18～20]。在温带地区和热带雨林中,大约30万种陆地植物都是内生真菌的宿主,每一种植物都有1种或多种内生真菌[21]。多数内生真菌隶属于子囊孢子类(Ascomycetes)。与细菌相比,大多数真菌表现出丝状的生长习性,这使其能够采取探索或利用周围环境的生长策略,形成聚合菌丝的线性器官,从而保护真菌的易位[22]。同时,真菌往往具有坚硬的细胞壁,这使其在恶劣的环境中得以存活。因此,水稻内生真菌也成为发掘微生物资源的热门领域。水稻内生真菌的分布同样具有时间和空间的选择性。Wang等[23]从江西东乡野生稻中分离出229株内生真菌,其中种子中的内生真菌数量最多,其次为叶、根和茎,表明内生真菌具有组织特异性,且研究者发现它们属于不同的菌属。崔凯[24]对水稻根、茎、叶中的内生真菌进行了分析,发现水稻的根部分布有很多的血赤壳属(Haematonectria)和根盘菌属(Rhizopycnis),但这两个菌属在水稻的茎和叶中几乎没有分布;毒麦种子内生真菌属(Gloeotinia)存在于水稻的茎和叶;念珠菌属(Candida)只分布在水稻的叶片。这进一步说明内生真菌在水稻体内的分布具有组织特异性。此外,当水稻受到外界胁迫时,其内生菌群落也会发生变化。崔凯[24]利用不同浓度的农药噻虫嗪对水稻进行处理,通过多样性分析发现,水稻在受到农药胁迫时,其根部的内生真菌多样性发生了提高,同时高浓度的噻虫嗪还可以提高水稻茎部和叶部内生真菌的多样性。

1.3 水稻内生放线菌

最早发现的内生放线菌是能在非豆科植物根部形成根瘤并具有固氮能力的弗兰克氏菌属(Frankia)[25]。随后,研究者们陆续从植物组织中分离出其他种类的内生放线菌,其中大部分属于链霉菌属(Streptomyces),此外还有诺卡氏菌属(Nocar-dia)、小双孢菌属(Microbispora)、北里孢菌属(Kitasatospora)等[26]。放线菌是具有经济价值和生物技术价值的原核生物,它们能够产生多种生物活性化合物,如抗生素、抗肿瘤药物和酶抑制剂等,同时它们的丝状菌丝和产孢特性使其能够在不利的环境条件下生存且便于开发应用[27],因此分离并利用水稻内生放线菌成为近年来生物防治的热门领域。

由于放线菌在土壤中的含量非常丰富,所以它们极有可能被水稻的根系分泌物所吸引并进入水稻体内。水稻品种、种植环境、定殖的器官等都可以成为影响水稻内生放线菌分布与定殖的因素。田新莉等[28]对广东省番禺和五山两地种植的水稻进行了内生放线菌的分离和鉴定,发现番禺和五山两地不同的土壤环境导致了水稻内生放线菌种类的不同,且根中的内生放线菌种类较茎和叶多。Jelita[29]对不同生态系统中不同水稻的内生放线菌的种群动态和形态特征进行了评估,发现水稻内生放线菌的种群动态和多样性受水稻植株的年龄、品种和生态系统类型的影响。以上分析表明,内生放线菌的分布受多种因素的影响。

2 水稻-内生菌的互利共生

内生菌与水稻在长期的共生环境下建立了十分复杂而巧妙的相互联系,并且通过这些不同方式的相互作用为双方创造了互利互惠的生长条件。根据作用对象的不同,我们将这些相互作用分为两种,一种是内生菌对水稻的影响,另一种则是水稻对内生菌的影响。

2.1 内生菌对水稻的影响

2.1.1 固氮作用

氮是叶绿素、氨基酸、含氮杂环碱基(嘌呤和嘧啶)等物质的主要成分,是植物生长和发育必不可少的大量元素之一。水稻的生产高度依赖氮元素,但土壤普遍缺氮的现状使得生产者必须施用大量氮肥来维持水稻生产,而大量使用氮肥会对环境造成不利影响,因此利用微生物进行的生物固氮吸引了研究者的目光[30]。内生固氮菌是指那些生活在植物体内,并能与宿主植物进行联合固氮的一类菌群[31]。常见的内生固氮菌有假单胞菌、固氮螺菌、肠杆菌和芽孢杆菌等,这些菌群能够在寄主植物不形成根瘤结构的前提下,通过自身的代谢系统,利用固氮酶将大气中游离的N2还原成植物可利用的NH4+,以供寄主植物使用。这类内生菌目前已有很多报道,其中,内生子囊菌被多次提到并证实能够提高植物氮素养分的吸收并改善寄主植物的生长状况[32～34]。

截至目前,已有不少具有固氮能力的内生菌被研究者从水稻组织中分离出来。研究报道,在低氮条件下,经过内生真菌Phomopsis liquidambari处理后的水稻的总产量以及氮素利用率相较于未处理的水稻分别提高了12%和11.59%[35];同时,该株内生真菌可以影响水稻根系分泌物的成分,从而调节根际微生物的群落结构[36]。

随着对内生固氮菌了解的深入,研究者已能够对水稻组织中原有的内生固氮菌进行基因修饰,以增加水稻自身固氮酶的活性,从而提高水稻的固氮能力[37]。

2.1.2 促生长作用

内生菌能够促进宿主植物生长的一个主要原因是具有产生植物激素的能力,其中吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)就是一类能够调节植物细胞伸长、细胞分裂以及根部形成等的天然植物激素[38]。研究人员发现,从水稻中分离得到的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)RRE25能够分泌IAA,进而促进水稻的生长,此外该内生菌还能协助宿主水稻提高氮、磷、钾的吸收效率。为了证实RRE25促生长的能力与IAA的分泌有关,研究人员利用基因改造技术获得了IAA产量提高数倍的过表达菌株,发现该过表达菌株能帮助水稻吸收更多的营养元素,进而促进水稻的生长和发育[39]。本实验室前期研究证明,水稻中的氢化链霉菌(Streptomyces hydrogenans)OsiLf-2和米修链霉菌(Streptomyces misionensis)OsiRt-1不仅可以分泌IAA,还可以分泌其他促生长相关物质,如铁载体、ACC脱氨酶等,从而促进水稻的生长发育[40～41]。除此之外,内生菌在一定程度上也可以影响水稻自身的激素分泌水平,例如:水稻中的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)RWL-1能够适量提高水稻中赤霉素及水杨酸的产生量,同时抑制茉莉酸和脱落酸的产生量,以促进水稻的生长[42]。相关研究显示,水稻内生菌的促生长作用与水稻品种无关。例如:经分离自水稻茎部的内生细菌固氮螺菌B510处理的3种不同品种的水稻,均表现出新生叶片生长良好、分蘖数和地上部分的生物量增加、水稻产量显著提高等现象[43]。

2.1.3 抵抗生物胁迫

生物胁迫是对植物生存与发育不利的各种生物因素的总称,通常由感染和竞争引起。水稻面临的生物胁迫主要有稻瘟病、纹枯病、稻白叶枯病等病害以及稻飞虱等虫害。传统防治中的农药不仅会破坏土壤的结构及性质,还会严重污染生态环境。因此,采用绿色、安全的微生物农药来达到防病除虫的目的,是当今农业生产的发展方向。

纹枯病在我国南方稻区危害严重,是当前水稻生产上的主要病害之一[44]。该病由立枯丝核菌引发,多在高温、高湿条件下发生,发病严重时常致叶片发黄枯死,使水稻不能抽穗,或使抽穗水稻的粒重下降。目前已有部分研究报道水稻内生菌能帮助抵御纹枯病,如Shabanamol等[45]从水稻中分离出一株内生固氮芽孢杆菌,该内生菌和传统杀菌剂多菌灵(Bavistin 50DF)协同处理水稻种子之后,可以诱导水稻产生更多的防御酶,减轻纹枯病的危害,并且内生菌处理后植物的抗病效果比化学杀菌剂更佳。

水稻恶苗病是一种由串珠镰刀菌引起的系统性侵染的真菌病害。水稻感染恶苗病后,一般不能抽穗或提早抽穗,穗小且结实很少[46]。研究显示,使用稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7007的悬浮液浸泡水稻根部,能够有效抑制水稻恶苗病的发展;水稻在接种YC7007六个小时后会积累更多的H2O2,同时细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)途径也被激活,表明YC7007能够启动水稻体内由ROS介导的防御机制。此外,研究还发现YC7007可以通过激活茉莉酸途径诱导植物产生针对病原菌的系统抗性[47]。

稻瘟病是由梨孢霉真菌引起的水稻重要病害之一,主要危害叶片、茎秆和穗部,引起水稻的大幅度减产。许多内生菌被报道可以抑制稻瘟病菌的生长,如从大蒜鳞茎中分离出来的内生菌D6、D10、D21和Y3。此外,一些内生菌的无菌发酵滤液也对稻瘟病菌有抑制效果,曾夏冬[40]在扫描电子显微镜下观察到,经过氢化链霉菌OsiLf-2发酵液处理的稻瘟病菌菌丝出现畸形和扭曲,这表明该内生菌对稻瘟病菌具有高效的抑制作用。另外,米修链霉菌OsiRt-1的发酵液也被证明可以抑制稻瘟病菌菌丝的生长[41]。

稻飞虱是一种对水稻危害较大的害虫,它主要吸食水稻汁液,导致水稻枯死,倒伏落塘。研究显示,内生菌可以产生生物碱等物质帮助植物抵抗虫害。例如:从水稻中分离的内生菌SJ-10可以明显降低植物中蚜虫的存活率,促进植物的生长发育[48]。

虽然关于内生菌协助水稻抵御生物胁迫的报道有很多,但目前对于内生菌防治病虫害的研究尚停留在起步阶段。根据现有的报道,水稻内生菌协助宿主水稻抗病的机制主要有分泌抗生物质、重寄生作用、生态位竞争和诱导水稻自身抗性等[49]。一些内生菌可通过多种机制共同作用协助水稻抵抗病害,如本实验室从水稻中分离得到一株具有良好抗稻瘟病效果的水稻内生菌吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)OsiSh-2,它不仅能够通过分泌抗生素等次级代谢物质抑制稻瘟病菌的生长,也可通过抢夺铁元素形成对稻瘟病菌的竞争抑制,更重要的是,它能够诱导水稻产生系统抗性,从而阻挡稻瘟病菌的入侵[50～52]。因此,在防治水稻病害时,表现出多重机制的内生菌会呈现出更强的效果。

2.1.4 抵御非生物胁迫

近年来,恶劣的环境条件对水稻等作物的危害越来越严重,随着全球极端天气出现的频率越来越高,非生物胁迫对农业生产的不利影响日益加剧[53]。因此,越来越多的研究者开始关注如何减缓农作物的非生物胁迫,内生菌则在这方面表现出突出的能力。比如,内生菌可以通过分泌胞外多糖改变植物周围的土壤结构和多孔性,从而使植物的根部能够更好地适应含水量变化的环境,进而有利于植物根部在土壤中的伸展[53]。遗憾的是,截至目前,仅有少数报道对内生菌协助宿主水稻抵御非生物胁迫的分子机制进行了研究,且大多还不够深入。

重金属污染严重影响粮食作物的生长发育,富集大量重金属的农作物会严重威胁人畜生命安全,因此解决重金属污染的问题刻不容缓。目前,已有文献报道内生菌能帮助重金属污染的植物进行生物修复,如Zhou等[55]发现嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)R5-5通过下调水稻体内编码镉吸收和转运蛋白的基因的表达,以及改变水稻内生菌的群落结构,显著降低了水稻植株中的镉含量。

干旱会影响全球粮食生产,造成粮食产量与质量大打折扣。有研究报道,深色有隔内生真菌(dark septate endophyte,DSE)可以通过降低水稻植株中的氧化应激反应和抗氧化酶的活性,使水稻细胞免受氧化损害,进而增强水稻在缺水条件下的耐受性[56]。

盐胁迫是最具破坏性的非生物胁迫之一,它会严重影响农作物的生长发育,最终导致农作物生产力下降。盐胁迫会对植物造成多种不可逆的损害,包括:初级和次级代谢活动受损、营养失衡和气孔导度降低、光合作用受到抑制等。在受到盐胁迫的后期,植物体内通常还伴随着离子胁迫和氧化胁迫的发生[57]。因此,内生菌介导的盐胁迫缓解受到了极大的关注。Sampangi-Ramaiah等[58]从耐盐的水稻品种中分离出一株镰刀菌(Fusarium sp.),进一步的研究显示其能使盐敏感水稻品种在高盐环境下健康生长,说明该内生菌能有效提高宿主的耐盐能力。随着越来越多的耐盐内生菌被分离出来,内生菌协助宿主水稻提高耐盐能力的机制也逐渐被揭示。例如:内生菌中的链霉菌(Streptomyces sp.)GMKU 336就是由于具有分泌ACC脱氨酶的能力,所以能够帮助水稻在高盐环境下生长[59]。此外,内生菌还可以通过产生IAA、赤霉素、有机酸,或分泌胞外多糖,帮助水稻抵抗盐胁迫,进而提高水稻的产量。从海稻的根部分离出的内生菌Pantoea alhagi NX-11,由于其能够产生大量的胞外多糖,所以在水稻受到盐胁迫时能显著提高水稻体内丙二醛和脯氨酸的含量,从而提高水稻的耐盐能力[60]。

2.2 水稻对内生菌的影响

如前文所述,目前大多数研究者都将目光投注于内生菌对水稻的影响。实际上,水稻对寄生在其体内的内生菌也具有一定影响。大量研究表明,水稻会主动改变或控制其体内生态环境,从而达到“选择”内生菌的目的[61～63]。根系分泌物就是帮助水稻选择内生菌的有效介质,它不仅仅是根际微生物的重要营养物质,也能够通过影响土壤微生物的趋化性来调控根际微生物侵染定殖进入水稻的过程[64～66]。比如:水稻的根系分泌物可以吸引固氮弧菌BH72定殖入其根部,且BH72的定殖能够帮助水稻提高对氮元素及其他营养物质的有效吸收[67];Walitang[68]在对不同水稻品种中的内生菌进行分离鉴定时发现,耐盐品种中存在大量的黄杆菌属内生菌,这些黄杆菌属内生菌具有较高的耐渗透胁迫能力,且在高盐地区种植的水稻中分布较多,表明内生菌的富集是水稻主动选择的结果。此外,相关研究报道水稻的代谢物可能影响内生菌的很多生长发育过程,包括铁螯合、获取和储存,群体感应,活性氧解毒,以及其他可能涉及氮循环的生物进程等[69]。

虽然现有研究已证实水稻具有主动选择内生菌的能力,但是人们对水稻与内生菌之间相互识别的分子机制还知之甚少。两者在相互识别时,信号如何传递？代谢进程在何时发生调整转换？这些都将是今后需要探究的目标。

3 水稻内生菌的应用前景

3.1 提取天然活性物质

植物与微生物的互作主要通过一些活性次生代谢产物来实现,如微生物产生的抗生素、植物激素及生物碱等物质,它们可以帮助植物抵抗病虫害,促进植物的生长。水稻内生放线菌被认为是生物活性代谢产物的重要来源[70],它产生的大环内酯类抗生素[71～72]、生物碱[73]和非核糖体多肽[74]等物质在农业中做出了巨大的贡献。例如:水稻内生菌链霉菌属(Streptomyces sp.)BCC72023可以产生具有抗细菌和抗真菌活性的大环内酯与聚醚类抗生素,这些代谢产物对成熟辣椒的辣椒炭疽病具有抗性[75]。此外,从内生菌中提取出来的活性物质还可以应用于临床试验。Shahzad等[76]从水稻内生的解淀粉芽孢杆菌RWL-1中分离得到了一种化合物,其与从短小芽孢杆菌和链格孢菌中分离的抗生素Al77F的化学结构相同,而且对α-葡萄糖苷酶和脲酶具有抑制作用,可以用作具有医疗价值的新型生物活性酶抑制剂。

3.2 制作生物肥料或生物农药菌剂

微生物肥料是指以微生物的生命活动为核心,使农作物获得特定的肥料效应的一类肥料制品。相比于传统的化学肥料,生物肥料具有高效、生产成本低、应用效果好以及环境污染小等优点。Pham等[77]从水稻中分离出来的内生菌固氮施氏假单胞菌A15在温室条件下能显著促进水稻幼苗的生长,且促生效果优于化肥,表明该菌有成为生物肥料的潜力。

生物农药是指利用生物活体或其代谢产物制成的制剂,可以有效地杀灭或抑制农业有害生物。随着我国农业生产方式的转变和对环保的极力追求,以及政策方面的大力推动,生物农药被逐渐重视并广泛开发。解淀粉芽孢杆菌Y19是一株具有IAA合成能力和固氮解磷活性的玉米内生细菌,蒋晓玲[78]将Y19制作成了微生物肥料,发现该菌肥不仅能够显著降低玉米茎腐病的发生(防治效率达到60%以上),而且还能改善玉米根际土壤的微生物区系,提高根际微生物的代谢活性,促进土壤中养分的活化和抑病型土壤的形成,这些功能均表明内生菌在生物农药方面具有巨大的优势。

4 内生菌的负面影响

目前,大多数的研究报道主要阐述了内生菌的促生长、抗胁迫等积极作用,然而在某些情况下,内生菌也会对宿主植物产生一些不利的影响。金玲等[79]在对大田小麦苗中的内生菌进行筛选时发现,有6株菌可以引起植株出苗迟、生长缓慢、矮化等现象。Deshmukh等[80]发现内生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)在大麦的根部定殖时,需要其宿主细胞死亡才能够促进根部的进一步发育。此外,Schulz等[81]认为宿主与内生菌之间存在一种平衡关系,该平衡取决于外界环境和宿主自身。当外界环境等发生改变时,某些内生菌可能会由于无法适应新的环境而对宿主植物产生负面影响。例如:未感染内生真菌的亚利桑那羊茅在营养缺乏的土地上生长时,其长势好于感染内生真菌的羊茅;但是在营养丰富的土地上,研究者并未观察到这一现象[82]。因此,我们推测水稻体内可能也存在着某些对其产生负面影响的内生菌。

5 总结与展望

近年来,植物内生菌成为植物和微生物工作者研究的热点。它在促进水稻生长,帮助水稻固氮,协助水稻抵抗病虫害,提高水稻对干旱、盐渍、重金属等非生物胁迫的耐受力等方面具有独特的优势。同时,水稻能主动“选择”内生菌并通过其分泌的代谢物影响内生菌的许多生长发育过程。但是,目前对内生菌和水稻互作的研究大多集中在生理生化层面和影响因素的探讨,分子机理层面的研究较少。此外,已有的研究显示,部分内生菌在某些情况下会对宿主植物产生负面影响。因此,内生菌和水稻互作的机制以及如何有效地解决内生菌的负面影响将会是未来研究的主流趋势,更加系统化、全面化地深入研究水稻与内生菌之间的相互关系将对我国农业生产和发展做出巨大的贡献。