花粉的表面增强拉曼光谱鉴别研究

符致秋，刘刚*，安冉，欧全宏，杨卫梅，李建美，时有明

(1.云南师范大学物理与电子信息学院，云南 昆明 650500；2.曲靖师范学院物理与电子工程学院，云南 曲靖 655011)

1 引言

雪松是世界四大观赏树之一，原产于喜马拉雅山地区，具有较强的防尘和减噪能力。雪松不仅具有观赏价值，也具有抗肿瘤、抗氧化、抗褐变、抗惊厥、抗菌和抗病毒等多种药理活性[1,2]。雪松花粉含有多种营养成分和生物活性物质，如20种氨基酸、15种维生素、类黄酮、不饱和脂肪酸和单糖等[3]。雪松花粉可为食品、保健食品和药品提供优质原料[4]。

蜂花粉也含有蛋白质、氨基酸、核酸、脂质、糖类和其他的营养物质，但与雪松花粉不同，雪松花粉还可以作为医疗用药治疗前列腺增生、抗衰老、抗疲劳、补血和增强免疫力等。而雪松花粉特有的营养价值与药用价值使其价格昂贵，蜂花粉相对便宜。蜂花粉的颜色与雪松花粉的颜色都为黄色或者淡黄色，外观上不易于区分。所以有些商家会在雪松花粉中掺杂蜂花粉用于售卖获取高额利润。

传统的花粉分类通常是用光学显微镜和扫描电子显微镜来识别，根据形态学特征 (颗粒的大小、形状、表面、孔径)进行鉴定[5,6]。也有其它方法用于花粉分类，如Dias等人用电子舌数据和化学计量工具相结合鉴定单花和多花蜂蜜中主要花粉的相对丰度[7]；Moore等人利用MALDI-ToF质谱联用技术对孢粉素的结构进行研究[8]；Kiselev等人用光谱分辨检测与闪光灯激励相结合，提出了一种基于氙灯激励和光谱分辨荧光采集的新型光学气溶胶粒子探测器，对三种天然花粉进行研究[9]；王谦等人分析了蜂花粉和松花粉两者营养成分的差异性，两者营养成分的种类大致相同，但含量差异大，蜂花粉中还原糖含量较高，而松花粉中膳食纤维含量较高[10]。以上这些方法对花粉的区分，其实验操作繁琐，有的耗时费力且成本高，并且对操作人员的要求比较高。

光谱法具有简单快速的特点，如O′Connor等人用荧光光谱结合主成分分析对8种花粉和5种真菌孢子进行研究，能有效地区分各种花粉[11]。红外光谱也用于花粉研究，如，徐小兰[12]等人运用FTIR光谱和二维相关红外光谱对花粉进行了分类；Zimmermann等人用FTIR对真菌孢子和植物花粉分类及估计其形态特征，测量出主要的空气变应原植物[13]，他们也用红外显微光谱对松科花粉和其他种类花粉的识别[14]，也对单个花粉粒的无散射FTIR显微测量，讨论了花粉粒的化学特征和光谱数据中形态参数的提取[15]，Zimmermann等人还用红外光谱对43种不同的松属植物花粉样品进行了比较研究，分析出振动光谱与花粉粒形态、生物化学和分类学之间具有明显的相关性[16]；Elena等人建立了6种致敏花粉粒的FT-IR参考光谱数据库[17]；Erzsebet等人用FTIR光谱对非洲紫堇属15个基因型的花粉进行了综合研究[18]。也有其他研究者用红外光谱结合其他工具对花粉进行研究，如结合荧光光谱[19]、化学计量[20]、无监督与监督多元统计方法[21]和扫描电子显微镜[22]等。红外光谱法虽然能简单快速得鉴别花粉，但红外光谱容易受到环境中水分和二氧化碳的影响。

拉曼光谱不受环境中水分和二氧化碳的影响，运用拉曼光谱对花粉的研究也比较多，Ivleva等人采用显微拉曼对豚草、白桦、英国栎、欧洲椴树等过敏相关花粉进行了化学表征，结合主成分分析和层次聚类分析对不同花粉种间鉴别[23]；Guedes等人建立34种花粉的拉曼光谱库，并对该数据库在空气样品中检测和鉴定花粉的适用性进行测试[24]；Wang等人用光敏扫描拉曼光谱系统研究空气中单个花粉/孢子颗粒的拉曼光谱[25]；Franziska等人用拉曼光谱结合高效薄层色谱法研究了不同树种的花粉粒中类胡萝卜素成分[26]。表面增强拉曼光谱技术作为一种高灵敏度的光谱分析方法，具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简单以及可以实现无损检测的特点，适合在食品安全快速检测领域[27]。本文利用扫描电子显微镜对雪松花粉和七种蜂花粉进行形貌观察，用表面增强拉曼光谱对雪松花粉和七种蜂花粉进行鉴别研究。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

实验仪器：拉曼光谱仪(ANDOR SR-500型，英国)；扫描电子显微镜(FEI Quanta250型，荷兰)；紫外-可见分光光度计(UV-2600型，日本岛津公司)；智力磁力搅拌器(ZNCL-DLT250ML*四联，上海瑞兹仪器设备有限公司)；高速离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；优普系列超纯水器(UPT-I-20T，四川优普超纯科技有限公司)。

拉曼测试条件：选用785 nm激光激发，热电冷却的iDUS 416 CCD检测器，采集光谱范围200～3500 cm-1，光谱分辨率4 cm-1，扫描时间为40 s，累加5次，到达样品上的功率约为6.4 mW。

实验试剂：硝酸银(99.8%，上海旭达精细化工厂)，柠檬酸钠(99.0%，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)，结晶紫(天津市科密欧化学试剂有限公司)，实验中所用到的水均为超纯水，水电阻率为17～18 MΩ·cm。

2.2 银纳米颗粒的制备

参考Lemma等人[28]的方法，用柠檬酸钠还原硝酸银制备银纳米颗粒。实验前均用稀硝酸浸泡实验相关的玻璃仪器，再用去离子水清洗，放干燥箱内烘干待用。银纳米颗粒的制备：称取硝酸银17 mg，用去离子水定容到100 mL，再将硝酸银溶液置于烧瓶中，在磁力搅拌器上不断搅拌并加热直至沸腾。然后迅速加入2 mL质量分数为1%的柠檬酸钠水溶液，保持溶液沸腾，持续搅拌60 min，然后冷却至室温。将得到的银溶胶纳米颗粒溶液转移入离心管中，然后将离心管放进高速离心机中离心(5000 rad/min) 30分钟，之后去除上清液，再加入去离子水，放到超声波中震荡，得到最终的银纳米颗粒放到4℃的冰箱中保存待用。检测前将所得银纳米颗粒滴加到硅片上，在真空干燥箱中干燥，之后于扫描电子显微镜中扫描得到电镜图，观察银纳米颗粒的形状及大小。银纳米颗粒大小统计采用Nano Measurer 1.2软件。

2.3 样品获取与实验操作

雪松花粉的获取：采摘雪松的花穗，晒干，过筛除去杂质再收集雪松花粉。七种蜂花粉的获取：益母草蜂花粉、油菜蜂花粉、茶花蜂花粉、荷花蜂花粉、玫瑰蜂花粉、荞麦蜂花粉和五味子蜂花粉，这些七种蜂花粉均购买于慈蜂堂(黑龙江小慈生态农业发展有限公司)

实验操作：把银溶胶溶液滴加到硅片上，放入真空干燥箱烘干(45℃)，然后置于激光显微拉曼光谱仪的物镜视野下，采集基底的拉曼光谱，作为空白组。取少量的雪松花粉置于硅片上，使用盖玻片将粉末压平再进行拉曼光谱扫描，作为对照组。花粉SERS的采集，取少量花粉置于硅片上再滴加适量银纳米颗粒溶液，将其烘干(45℃)成糊状后压平再进行扫描。每种光谱的采集均换三个不同区域进行采集，每次采集两次。实验采集到的所有拉曼光谱数据均采用Origin8.6软件处理。

3 结果与分析

3.1 银纳米颗粒的增强作用

图1(a)为柠檬酸钠还原硝酸银制备的银纳米颗粒的扫描电子显微镜图，所得的银纳米颗粒无银纳米棒出现，大小为不均匀的纳米颗粒。图1(b)为银纳米颗粒的大小尺寸分布统计图，粒径主要在100～140 nm之间。

图1 银纳米颗粒的SEM(a)与尺寸分布图(b)Fig.1 SEM (a) and size distribution profile (b) of silver nanoparticles

用结晶紫作为探针分子，检验基底的增强效果。结果如图2，图2(a)为10-4mol/L结晶紫的拉曼光谱图，在520 cm-1出现拉曼信号，主要是来自衬底硅片单晶硅的拉曼振动峰，在其它范围没有出现拉曼信号；图2(b)为浓度为10-4mol/L结晶紫的表面增强拉曼光谱图增，从图中可以看出，银纳米颗粒对结晶紫的表面增强效果明显。

图2 结晶紫的拉曼光谱(a)和(b)表面增强拉曼光谱图Fig.2 Normal Raman (a) and SERS (b) of crystal violet

3.2 八种花粉的SEM图

用SEM观察蜂花粉与雪松花粉在比例尺为50 μm的情况下的外形结构，如图3所示，益母草蜂花粉接近圆形，表层有三条发芽沟；油菜蜂花粉、荞麦蜂花粉和五味子蜂花粉三者非常相似，呈现椭圆形，表面有精细的网状结构，只有一条发芽沟；茶花蜂花粉形态与益母草蜂花粉相似，表层有三条发芽沟；荷花蜂花粉近似圆形，表层光滑，有一条发芽沟；玫瑰蜂花粉体型较小，近似梭形，表层光滑，有三条发芽沟；雪松花粉形状近似圆形，体型较大，表面光滑，有一条发芽沟。

图3 八种花粉的SEM图Fig.3 SEM images of eight kinds of pollen

图4为雪松花粉与银纳米颗粒结合的SEM图，从图4(a)明显可看出，银纳米颗粒不均匀地附着在每个花粉粒子表面，有部分区域附着的银纳米颗粒相对多。

3.3 雪松花粉的拉曼光谱图

图5为雪松花粉在1800-450 cm-1范围内的SERS图，图5(a)为银纳米颗粒的拉曼光谱，在此范围内，银纳米颗粒的拉曼光谱显示微弱的拉曼信号。图4(b)为雪松花粉的拉曼光谱图，可以看出在1702、1513、1382、1243、1011、793 cm-1等位出现了微弱的拉曼信号，只有在1680 cm-1附近拉曼信号较强，拉曼光谱除了在1680 cm-1处信号较强，其它位置的信号都比较弱。图5(c)为雪松花粉的SERS图，在1701、1657、1572、1522、1397、1293、1208、810、565 cm-1等现了明显的拉曼信号。

图4 雪松花粉与银纳米颗粒混合的SEM图Fig.4 SEM images of Pinus massoniana Lamb pollens and its mixture with silver nanoparticles

图5 (a)银纳米颗粒背景的拉曼光谱；(b)雪松花粉拉曼光谱；(c)雪松花粉SERS光谱Fig.5 (a) Raman spectrum of silver nanoparticles;(b) Raman spectrum of Pinus massoniana Lamb pollen;(c) SERS of Pinus massoniana Lamb pollen

在1657 cm-1附近是C=O双键的伸缩振动峰，在1572 cm-1附近的强带主要是花粉拉曼光谱的共同特征，对应于苯丙氨酸和酪氨酸[29]。在1397 cm-1处是CN的伸缩振动和CH3的对称伸缩振动，在1446 cm-1附近是CH3的反对称振动峰。在1293 cm-1及1011 cm-1处存在的2个苯丙氨酸残基的振动峰，以上振动峰是蛋白质的振动峰。在1522 cm-1处主要是C=C的伸缩振动峰；在1500-1200 cm-1区间有几个较宽的振动峰，这主要是C-H 键的变形振动。810 cm-1处主要是C-C键和C-O键的对称伸缩振动峰，为多糖类的振动峰。在1446 cm-1，1397 cm-1及1382 cm-1处的振动峰，属于不饱和脂肪族链中CH2/CH3的变形振动峰，由长链脂肪酸分子中的甲基、亚甲基产生的。

3.4 雪松花粉与蜂花粉的表面增强拉曼光谱的比较

图6为雪松花粉与七种蜂花粉在800～450 cm-1范围的表面增强拉曼光谱图。图6(a)为茶花蜂花粉的SERS图，从图中可以看出茶花蜂花粉在1584、1526、1158、1130、1005和749 cm-1出现了明显的拉曼信号峰；图6(b)为荷花蜂花粉的SERS图，从图中可以看出荷花蜂花粉分别在1629、1489、1462和895 cm-1出现了较强的拉曼信号峰，虽然出现的拉曼信号较少，但比较明显；图6(c)为玫瑰蜂花粉的SERS图，图中显示玫瑰蜂花粉的拉曼信号在1651、1608、1578、1439、1362、1244、1177、818、581、521和419 cm-1处，出现的拉曼信号较多；图6(d)为荞麦蜂花粉的SRES图，图中显示荞麦蜂花粉的的拉曼信号主要在1626、1605、1439、1298和1167 cm-1处；图6(e)为五味子蜂花粉的SERS图，五味子蜂花粉的拉曼信号主要在1605、1526和1158 cm-1附近；图6(f)为益母草蜂花粉的SERS图，益母草蜂花粉的拉曼信号主要在1662和1460 cm-1附近；图6(g)为油菜蜂花粉的SERS图，油菜蜂花粉的拉曼信号主要在1602和1167 cm-1处，拉曼信号较少；图6(h)为雪松花粉的SERS图，雪松花粉的拉曼信号主要在1701、1657、1572、1404、1292、1208、1084、810和565 cm-1附近，拉曼信号较多。从图6中可以看出雪松花粉与蜂花粉拉曼峰的个数、位置以及强度不同，并且雪松花粉的拉曼信号较多且清晰。拉曼光谱的差异表明不同花粉间成分的差异，根据表面增强拉曼光谱可以简单快速鉴别雪松花粉和蜂花粉。

图6 八种花粉在1800-400 cm-1范围内表面增强拉曼光谱：(a)茶花蜂花粉；(b)荷花蜂花粉；(c)玫瑰蜂花粉；(d)荞麦蜂花粉；(e)五味子蜂花粉；(f)益母草蜂花粉；(g)油菜蜂花粉；(h)雪松花粉Fig.6 SERS of eight kinds of pollen in the range of 1800-400 cm-1:(a) camellia pollen;(b) lotus pollen;(c)rose pollen;(d) buckwheat pollen;(e) schisandra pollen;(f) motherwort pollen;(g) rape pollen;(h) Pinus massoniana lamb pollen

3.5 蜂花粉拉曼光谱的比较

如图3所示，SEM的结果显示出油菜蜂花粉、荞麦蜂花粉与五味子蜂花粉的形貌特征非常相似，在显微电镜下不易区分油菜蜂花粉、荞麦蜂花粉和五味子蜂花粉这三种蜂花粉。用1800-1000 cm-1范围内的表面增强拉曼光谱鉴别这三种蜂花粉，从图6中可以看出油菜蜂花粉的SERS拉曼峰较少，信号主要出现在1602和1167 cm-1附近，1602 cm-1附近出现最强峰；荞麦蜂花粉的SRES图显示拉曼峰主要在1626、1605、1439、1298和1167 cm-1附近，最强峰出现在1605 cm-1附近，1439 cm-1附近的拉曼峰归属为孢粉素油脂中C-H2的弯曲振动，1298 cm-1附近的拉曼峰归属为C-H和N-H的弯曲振动，可知道荞麦蜂花粉与其他两种种蜂花粉的蛋白质结构和外壁主要成分都不同，把1439和1298 cm-1作为荞麦蜂花粉区分其他两种蜂花粉的特征峰；五味子蜂花粉的拉曼信号显示出1605、1526和1158 cm-1三处明显的峰，1526 cm-1为在三种蜂花粉中五味子蜂花粉特有的峰，则1526 cm-1附近的峰可以为五味子蜂花粉区分油菜和荞麦蜂花粉拉曼主要特征峰。显微电镜不能区分油菜、荞麦与五味子蜂花粉，因此表面增强拉曼光谱可以简单快速区分油菜、荞麦与五味子蜂花粉。

益母草蜂花粉与茶花蜂花粉的形貌特征也非常相似(图3)，在扫描电子显微镜下不能区分二者。运用表面增强拉曼光谱鉴别此二者。图6可以看出二者的拉曼信号峰差别较大，从益母草蜂花粉的SERS图可知，益母草蜂花粉的拉曼信号峰主要在1662和1460 cm-1附近出现两个强度接近的峰；而从茶花蜂花粉的SERS可以看出，茶花蜂花粉在1582、1526、1158、1130、1005和749 cm-1附近出现六个明显的拉曼信号峰，并且在1526和1158 cm-1处出现两个很强的拉曼峰。因此用表面增强拉曼光谱可以简单快速的区分形貌特征相似的益母草蜂花粉与茶花蜂花粉。

4 结论

本文用扫描电子显微镜对雪松花粉和七种蜂花粉进行形貌观察，观察出油菜蜂花粉、荞麦蜂花粉和五味子蜂花粉三者形态差异微小，茶花蜂花粉与益母草蜂花粉形态差异微小，用扫描电子显微镜难于区分这几种峰花粉。通过银纳米粒子可以有效地增强花粉的拉曼信号，雪松花粉主要特征峰出现在1701、1657、1572、1522、1397、1293、1208、810和565 cm-1附近；油菜蜂花粉主要征峰在1602和1167 cm-1附近；荞麦蜂花粉主要特征峰在1439和1298 cm-1附近；五味子蜂花粉特征峰在1605、1526和1158 cm-1附近；益母草蜂花粉主要特征峰在1662和1460 cm-1附近；茶花蜂花粉在1582、1526、1158、1130、1005和749 cm-1附近出现六个明显的拉曼特征峰。由于花粉表面增强拉曼光谱的特征峰位置和强度显示出明显的差异。因此，表面增强拉曼光谱可以简单快速的鉴别各类花粉。