阿尔茨海默病患者血清miR-137的表达及其与预后的关系

乔卫东 陈晓光 云望

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)又称老年痴呆，是常见的神经系统退行性病变，主要表现为认知功能障碍[1]。AD多发于70岁以上人群，且随年龄增加，患AD的概率越高，在65岁以上中老年人中AD的患病率为5%左右，85岁以上则增加至20%[2]。因此及时诊断具有重要意义[3]。目前有关AD发病的具体原因尚不清楚，其发病机制主要包括微管相关蛋白tau异常学说、β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)毒性学说、载脂蛋白基因多态性学说、早老素基因突变学说4种，其中Aβ毒性学说近年来研究较多[4]。研究表明，脑内Aβ沉积和神经炎症参与AD发生发展，AD患者中多种微小RNA(microRNA，miRNA)异常表达，如神经元中miR-137异常下调，可能与AD的发病机制有关，其作用可能与通过参与调控与炎症反应有关的信号通路有关[5-6]。但miR-137与AD发病机制的相关研究大多停留在细胞模型与动物模型，其在AD患者中表达情况尚不清楚。本研究通过检测AD患者血清miR-137的表达情况，旨在探讨miR-137与患者预后的关系。

1 对象和方法

1.1 对象选取2017年1月至2019年1月作者医院收治的AD患者150例，其中男76例、女74例；年龄60～88岁，平均(75.8±7.6)岁；合并高血压55例，头部受重伤史5例，吸烟史53例；初中及以下学历87例；体重指数(BMI)为23.61±2.95。纳入标准：(1)AD诊断符合美国国立神经病、语言疾病和卒中研究所与AD及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)标准[7]；(2)14分≤MMSE评分≤23分；(3)年龄≥55岁。排除标准：(1)不同意参与本研究者；(2)存在意识障碍，无法进行正常交流者；(3)合并有心、肝、肾等器质性病变者；(4)贫血、听力视力严重受损者；(5)病历资料不完整者。另取同期在本院进行体检的健康者150名作为对照组，其中男77名、女73名；年龄57～89岁，平均(74.0±8.3)岁；合并高血压53例，头部受重伤史8例，吸烟史54例；初中及以下学历62例；BMI为22.98±2.85。两组间性别构成、年龄、高血压、BMI、头部受伤史、吸烟史比较差异无统计学意义(均P>0.05)，AD组初中及以下学历比例高于对照组(P<0.05)。该研究经作者医院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字。

1.2 主要试剂与仪器RNA提取试剂盒(货号：DP443)购自北京天根生化有限公司，AceQ qPCR SYBR® Green Mix(货号：Q221-01)购自南京Vazyme生物公司，引物由上海生工生物公司设计合成，qRT-PCR仪(型号：CFX96)购自美国Bio-Rad公司，全自动生化测定仪(型号：日立 7600)购自株式会社日立制作所，酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(货号：JK-0322)购自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1样品制备：取患者清晨空腹外周血5 mL，置无抗凝剂的普通采血管中。取其中2 mL血静置30 min，以4000 r/min(离心半径=13.5 cm)离心10 min，取上血清分装于EP管中，标记好后置-80℃保存备用；余3 mL置于EDTA抗凝管中，静置离心后取血浆分装于EP管中，标记好之后置-80℃保存备用。

1.3.2血生化指标检测：采用全自动生化分析仪测定患者血清总胆固醇(total cholesterol，TG)、三酰甘油(triglyceride，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)、脂联素(adiponectin，ANP)水平。按照仪器以及试剂盒说明书严格操作，由检验科同一批人员在同台仪器上操作，每个样本重复3次。

1.3.3实时荧光定量PCR检测miR-137表达水平：采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，反转录得cDNA。采用定量PCR仪对miR-137进行扩增。qRT-PCR反应体系共10 μL，包括miScript SYBR® Green Mix 5 μL、cDNA(50 ng/μL)1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、ddH2O 3.0 μL。反应条件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40个循环。miR-137上游引物：5′-GAAATCCGACAGCTTAAGGAGGTTTGA-3′；下游引物：5′-CATTGCACAGATAGGATTTGATTTACT-3′。以U6为内参基因，上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-CAT-3′。采用2-ΔΔCT法计算血清miR-137表达水平。

1.3.4简明精神状态量表(MMSE)：由两位精神科主治医师在安静环境中对患者(入组后第2天7：00～9：00)和对照组(体检当天7：00～9：00)进行MMSE测量，主要包括定向力、记忆力、注意力与计算力、回忆力、语言表达能力等项目，分值分别为10分、3分、5分、3分、9分，总分为30分，≥27分表示认知功能正常，分数越高，认知功能越好。受教育小于12年者总得分加一分进行校准[8]。

1.3.5血Aβ水平检测：采用ELISA法检测血浆Aβ40、Aβ42水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，并计算Aβ40/Aβ42比值。

1.3.6随访：对AD患者进行为期6个月的随访，2019年6月30日为随访终止时间，以随访截止时AD患者生存状况分组，分为预后良好组(生存)和预后不良组(死亡)组[9]。

1.4 统计学处理用SPSS 23.0进行统计学分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两均数比较采用t检验；计数资料采用率表示，采用卡方检验；采用Pearson相关分析AD组患者血清miR-137水平与血生化指标的相关性及血浆Aβ42、Aβ42/Aβ40与血清LDL-C、Hcy、ANP的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-137表达水平比较AD组患者血清miR-137表达水平低于对照组(0.42±0.03比1.01±0.14；t=50.469，P<0.01)。

2.2 两组血生化和MMSE评分比较与对照组比较，AD组血清Hcy、LDL-C、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值较高(均P<0.05)，而ANP水平及MMSE评分较低(P<0.05)。结果见表1。

表1 两组血生化指标比较

2.3 AD患者血清miR-137水平与血生化指标的相关性AD患者血清miR-137表达水平与LDL-C、Hcy、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值呈负相关(均P<0.05)，与ANP水平、MMSE评分呈正相关(均P<0.05)。结果见表2所示。

表2 AD组患者血清miR-137表达水平与血生化各指标的Pearson相关性分析结果

2.4 AD患者血浆Aβ与血清LDL-C、Hcy、ANP的相关性AD患者血浆Aβ42、Aβ42/Aβ40比值均与LDL-C、Hcy呈正相关(P<0.05)，与ANP呈负相关(P<0.05)。结果见表3。

表3 AD患者血浆Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值与血清LDL-C、Hcy、ANP水平的相关性

2.5 不同预后AD患者血清miR-137表达水平比较150例AD患者中，预后良好137例，预后不良13例。预后不良者中因肺部感受死亡6例，多器官衰竭死亡5例，脑卒中死亡2例。预后良好患者miR-137表达水平高于预后不良者(0.49±0.05比0.31±0.02；t=20.256，P<0.05)。

3 讨论

AD给患者家庭造成严重的经济和精神压力，寻找AD相关标志物、及时预防以及尽早预测其发展极其重要[10]。既往研究表明，临床生化指标TG、TC、HDL-C等与AD、自发性脑出血等脑部疾病有关[11-13]。本研究结果显示，AD组与对照组TG、TC、HDL-C水平比较并无统计学差异，可能与入组病例地域不同有关，亦可能与本研究为单中心研究有关。

miRNA是一种可以对基因进行转录后调控的单链非编码RNA，在神经退行性疾病进展中起重要调控作用[14]。Ross等[15]研究发现，上调miR-431表达可保护神经突触，防止神经元退变，可能是AD的治疗靶点。Wu等[16]研究证实，AD患者血清miR-29c-3p表达水平降低，过表达时可通过调控STAT3磷酸化水平减轻小鼠模型认知功能障碍。本研究发现，与对照组比较，AD患者血清miR-137表达水平低，提示血清miR-137低表达可能与AD的发生有关。有研究报道，miR-137在精神分裂症患者外周血中表达异常，对精神分裂症患者认知功能障碍发生有预测作用，可能与神经突触的结构和功能改变有关[17]，提示miR-137可能通过影响突触、神经元结构和功能参与AD进展。MMSE量表评分可快速、全面、准确地反映被试者的智力状态以及认知功能，可反映AD患者的预后情况[18]。本研究结果显示，AD患者血清miR-137表达水平与MMSE评分呈正相关，且预后良好AD患者miR-137表达水平高于预后不良者，提示miR-137表达水平降低可能提示AD患者预后不良。

有研究发现，血清中Hcy、LDL-C、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值变化与认知功能障碍发生、神经元损伤等密切相关[11-13，19]。AD患者血浆Hcy表达水平升高，与MMSE评分呈负相关，是AD认知功能减退的独立危险因素[9]。Chang等[12]研究发现，自发性脑出血患者血清LDL-C高水平可能预示住院死亡率低。李晖等[13]研究显示，AD患者血清ANP表达水平明显降低，与痴呆严重程度呈负相关。本研究结果显示，与对照组比较，AD组血清Hcy、LDL-C水平较高，血清ANP水平较低。这与上述研究结果一致[11-13]，提示血清Hcy、LDL-C水平升高及ANP水平降低可能预示AD患者病情加重和不良预后。本研究亦发现，AD患者血清miR-137表达水平与LDL-C、Hcy水平呈负相关，与ANP水平呈正相关，提示miR-137可能与Hcy、LDL-C、ANP相互作用，共同预示AD病情严重程度和患者不良预后进展。

AD病灶始于大脑中与学习和记忆有关的区域，随病情进展病变区域逐渐扩散至海马、皮质层，同时伴有神经突触丧失、神经元丢失、Aβ形成积累[20]。Aβ蛋白在脑细胞外间隙表达增多可造成神经突触损伤和神经元死亡，加剧AD患者预后不良[19]。本研究结果显示，与对照组相比，AD组血浆Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值较高，提示Aβ蛋白可能与AD患者不良预后进展有关。Reed等[21]研究表明，下调血清LDL-C可通过减缓Aβ蛋白沉积，减少AD发生。张维文等通过给予脑缺血大鼠脑Hcy注射发现，大鼠脑Aβ42表达明显增加，加重其脑损伤后记忆功能障碍[22]。Jian等[23]研究证实，ANP缺失可引起促炎细胞因子释放Aβ蛋白，可能作为神经炎症抑制剂，影响AD进展。本研究结果显示，AD组患者血浆Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值均与LDL-C、Hcy呈正相关，与ANP呈负相关，提示LDL-C、Hcy、ANP可能通过影响Aβ蛋白水平，参与神经炎症反应、神经突触及神经元功能调节，导致AD患者不良预后发生。

有研究表明，miR-137下调可促进AD患者脑部Aβ蛋白的产生，从而影响AD严重程度[24]；下调miR-137水平可调节Aβ蛋白表达，降低神经炎症水平[25]。本研究结果发现，AD患者血清中miR-137表达水平与Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值呈负相关，提示miR-137可能通过调控LDL-C、Hcy、ANP水平，影响Aβ蛋白促进的神经炎症发生，促进AD进展及不良预后发生。

综上所述，本研究结果显示，miR-137在AD患者血清中表达水平下调，其降低与AD患者预后不良有关，临床应加强关注老年人血清miR-137水平的动态变化。有关miR-137表达水平对AD患者预后的具体影响尚需进一步深入研究。