全基因组拷贝数变异测序检测胎儿生长受限染色体异常的诊断价值 *

罗小金，郭岩芸，黄和明，韦升市，刘金星，陈婧，曹宪振，欧德标，白江涛

(1.深圳市龙岗区妇幼保健院中心实验室，广东深圳518172； 2.深圳市龙岗区人民医院妇产科，广东深圳518172)

在我国，胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)发生率为6%～10%，是导致围产死亡的主要原因之一[1]。导致FGR的因素比较复杂，主要包括胎儿、母体和胎盘因素，在胎儿因素中遗传学的染色体和全基因组拷贝数变异(copy number variations, CNVs)是主要原因之一[2]。以往因传统G显带染色体检测技术的局限性，只能分辨大于10 Mb的染色体异常，部分病例是否因遗传因素导致FGR或导致FGR的具体遗传机制并不明确。近年来，随着二代测序技术(next generation sequencing, NGS)在临床上的广泛应用，研究表明，基于NGS的全基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing, CNV-Seq)相较于传统核型分析、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、荧光原位杂交(FISH)及染色体微阵列分析(CMA)等技术具有高分辨率，高准确性和高基因组覆盖率等优势，可以检出100 kb以上的染色体拷贝数变异情况[3]。本研究通过对138例FGR胎儿同时进行G显带核型分析和CNV-Seq检测，评估基于NGS的低深度全基因组CNV-Seq在明确产前诊断FGR染色体异常的临床价值。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2018年4月至2020年10月深圳市龙岗区妇幼保健院因超声诊断为FGR且进行侵入性产前诊断分析的138例胎儿，均行G显带核型分析和CNV-Seq检测。孕妇年龄(29±4)岁，初产妇94例，经产妇44例，胎儿诊断为FGR时的孕周为(24±3)周，行侵入性产前诊断时的孕周为(25±3)周。FGR诊断标准：综合末次月经、月经史及早孕期B超确定孕龄，利用Hadlock公式计算胎儿体重，低于同孕周正常胎儿平均体重的第10百分位数定义为FGR。排除明确由母体妊娠期高血压疾病、母体感染及母体营养因素异常等原因引起的FGR。本研究经过龙岗区妇幼保健院医学伦理委员会审核批准(No.LGFYYXLL-028)，各研究对象及家属均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)，T4 DNA聚合酶、KlennowDNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶(美国ABI公司)，寡核苷酸试剂盒(美国Illumina公司)，PCR扩增产物纯化试剂盒(美国Beckman Coulter公司)，吉姆萨染液(珠海贝索公司)，羊水培养基(广州和能生物公司)。PCR扩增仪(美国Thermo Fisher公司)，2100 Bio-analyzer 生化分析仪(美国Agilent公司)，HiSeq2000高通量测序仪(美国Illumina公司)，CDS-5染色体分散仪(美国Thermotron公司)，LeicaGSL120全自动核型扫描分析系统(德国Lecica公司)。

1.3CNV-Seq检测 无菌条件下穿刺取10 mL羊水，1 600 r/min离心10 min，去上清液，按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA备用，用超声波打断、末端修复、加polyA尾和接头，加入引物PCR，构建DNA文库，采用Agilent2100生物分析仪和荧光定量PCR对文库进行定量质控。采用HiSeq2000测序平台按50SE单末端10 M数据量进行测序，CNV-Seq检测要求每例DNA量≥10 ng。通过Genome Analyzer Ⅱx分析软件对比将每个测序标签匹配到对应染色体，进行标准化Z值分析，并进行染色体CNV的判定，检测范围为>100 kb的CNVs。检出的CNVs与人类基因组拷贝数变异数据库(Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Human using Ensembl Resourses, DECIPHER)、人类基因组拷贝数变异多态性数据库(Database of Genomic Variants, DGV)和在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)进行匹配比对分析。根据美国医学遗传学会(American College of Medical Genetics, ACMG)指南[4]，CNVs判读分类为致病性/可能致病性临床意义不明拷贝数(VOUS)，可能良性/良性。

1.4核型分析 无菌条件下穿刺取15～20 mL羊水，1 600 r/min离心10 min,去上清液，常规方法[5]进行细胞接种培养、收获、制片及G或N显带染色体核型分析，使用LeicaGSL120全自动核型扫描分析系统扫描玻片上的100个分裂相，挑选长短适中、分散良好核型计数20个，随机分析5个，嵌合体及异常核型加倍计数至100个。核型诊断标准依据人类细胞遗传学国际命名体系(ISCN2016)[6]判读。

1.5短串联重复序列(STR)检测 按照ABI 3130测序仪及Identifier Plus试剂盒说明书对羊水和外周血标本D3S818、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D8S1179、PENTAE、AMELOGENIN等15个STR基因座进行检测，应用GeneMapper V3.2自动分析软件进行STR基因分型，平行分析以检测是否存在母体组织污染。

1.6统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料组间率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CNV-Seq与G显带核型分析对>10 Mb染色体异常的检出结果 138例FGR病例中G显带核型分析检出12例>10 Mb染色体异常(8.7%,12/138)，包括3例数目异常(分别为2例21三体和1例45,X)、9例结构异常(分别为2例平衡易位、4例缺失或重复和1例新衍生染色体)，还检出1例低比例嵌合体。CNV-Seq检出9例>10 Mb染色体异常(6.5%,9/138)，2例平衡易位(分别为病例11、12)和1例(病例10)低比例嵌合体(表1)。

表1 核型异常的FGR病例中CNV-Seq检测结果分析

2.2CNV-Seq和G显带核型分析对<10 Mb染色体CNVs的检出结果 138例FGR病例中G显带核型分析检出1例(病例18)<10 Mb染色体异常。CNV-Seq检测出11例<10 Mb染色体CNVs(8.0%,11/138)，其中致病性CNVs 8例(5.8%，8/138)(病例13～20)，包括2例Williams-Beuren综合征、2例16p微缺失/微重复综合征、1例Miller-Dieker综合征、1例Wolf-Hirschhorn综合征、1例3q29缺失综合征，1例2号染色体父源单亲二倍体(uniparental disomy, UPD)，均涉及生长发育迟缓、智力障碍或超声结构异常等相应的综合征表型。另外检出3例VOUS(2.2%,3/138)(病例21～23)，主要包括2例微缺失和1例微重复(涉及片段0.2～0.5 Mb)，所含致病基因包括ERCC8、NDUFAF2、FUT3、FUT6、ADAMTS2、GRM6、WWOX(表2)。

表2 核型正常FGR病例中异常CNV-Seq检测结果分析

2.3CNV-Seq与G显带核型分析对FGR检测结果的对比 138例FGR标本中采用G显带核型分析检出染色体异常13例(9.4%,13/138)，采用CNV-Seq检出20例(14.5%,20/138)。两种方法对非整倍体异常和>10 Mb的CNVs的检出率均为4.3%(6/138)，差异无统计学意义(χ2=0.000,P>0.05)。对<10 Mb的CNVs的检出率分别为0.7%(1/138)和3.5%(12/138)，差异有统计学意义(χ2=9.768,P<0.05)。G显带核型分析检出平衡易位/嵌合体3例(2.2%)，CNV-Seq未能检出上述病例。见表3。

表3 核型分析和CNV-Seq对138例FGR病例的检测结果对比分析[n(%)]

3 讨论

FGR的发病涉及多种因素，传统观点认为5%～20%的FGR由胎儿染色体异常所导致[7]。研究显示，239例FGR胎儿同时行核型分析和CMA技术可检出染色体异常37例(15.5%)，证实核型分析结合CMA可显著提高FGR染色体异常检出率[8]。相较于传统核型分析，本研究使用的CNV-Seq技术具有高通量、高分辨率和高敏感性等优势，相较于全基因组高通量测序具有深度低、耗时短和成本低等优势。本研究中，采用G显带核型分析结合CNV-Seq技术共检出染色体异常16.7%(23/138)，此外，采用CNV-Seq技术额外检出7.2%(10/138)染色体CNVs，证实CNV-Seq应用于产前检测染色体CNVs与CMA具有同等检出功效。相较于CMA技术，CNV-Seq具有全基因组均匀覆盖的优点[9]。本研究中2例平衡易位CNV-Seq未能有效检出，原因在于目前CNV-Seq测序法为单端测序，无法检出不涉及基因剂量改变的染色体异常。理论上平衡易位不存在遗传物质增减，但不排除断裂点破坏关键基因表达导致胚胎停育。本研究中通过G显带核型分析检出1例(病例12)X与6号染色体平衡易位，其断裂点位于Xp22的矮小同源盒(short stature homeobox containing,SHOX)基因区域，SHOX基因缺陷与身材矮小关系密切，属于单倍剂量敏感性基因，其杂合缺失或变异可造成Leri-Weill软骨生成障碍或特发性身材矮小[10]。

研究显示，在核型正常的FGR或合并其他超声异常的FGR病例中，基因芯片能额外检出8%的染色体CNVs[11]。本研究在核型正常的125例FGR胎儿中，采用CNV-Seq技术额外检出7.2%(10/138)小于10 Mb染色体CNVs。致病性CNVs因基因剂量改变、基因断裂及位置效应等方式干扰基因编码蛋白的功能，可导致相应的FGR及其他临床特征[12]。本研究检出的6例致病性CNVs中除1例单亲二倍体外，其他5例均具有明确的综合征临床表型。有文献资料显示，Williams-Beuren综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、Miller-Dieker综合征和16p11重复综合征在胎儿时期主要表现为生长发育迟滞、多器官畸形等临床表型，胎儿FGR是其产前超声较为明显的指征[13]。本研究显示CNV-seq在产前可以检出传统G显带核型无法检出的与FGR相关的微缺失微重复综合征，可有效明确其遗传学致病机制。

本研究中的病例18为新发突变的VOUS，区域内含ERCC8和NDUFAF2致病基因，但该胚胎停育是否上述基因杂合缺失导致，还需进一步的功能实验验证。病例19～20的VOUS为遗传自双亲之一，虽缺失/重复区域内含致病基因，但均足月分娩表型正常婴儿。现行CNVs分类中，VOUS的评分标准(-0.89～0.89)比较宽泛，VOUS的检出容易对实验室技术人员和遗传咨询医师造成极大困扰。产前检出VOUS后，父母行CNV-Seq检测有助于结果解释和明确遗传学病因。通常认为VOUS遗传自双亲之一时，其临床意义相对较小，VOUS为新发突变时则反之，但无论是遗传还是新发，均可因外显率和表现度的差异导致临床表型不一致[14]。

本研究还发现，在138例FGR病例中，G显带核型分析和CNV-Seq对染色体非整倍体异常和>10 Mb的CNVs检出率基本一致，通过对比分析，差异无统计学意义(χ2=0.000,P>0.05)。而对于<10 Mb的微缺失/微重复综合征的检出，CNV-Seq相较于G显带核型分析具有显著优势，CNV-Seq能额外检出10例(7.2%,10/138)与FGR相关的小片段致病性CNVs。然而，CNV-Seq也存在技术局限性，例如不能检出平衡易位和倒位、低比例嵌合、点突变等[15]。作为新兴的诊疗技术，CNV-Seq在临床应用仍存在颇多挑战，尚有较多检测的CNVs无法作出合理的临床解释[16]。

综上所述，本研究通过与传统的G显带核型分析对比分析，明确了基于NGS技术的CNV-Seq除可准确检出产前FGR常见的涉及大片段CNVs的染色体非整倍体和结构异常外，还能有效检出10 Mb以下的致病性CNVs及其导致的相关微缺失和微重复综合征，能更系统地揭示FGR的遗传学病因，科学指导孕妇妊娠选择。